微生物法煙酰胺生產(chǎn)菌的篩選及其催化條件的優(yōu)化.pdf

1、煙酰胺作為B族維生素的重要成員，參與了機(jī)體內(nèi)兩種重要輔酶的形成。煙酰胺作為重要的營(yíng)養(yǎng)性添加劑被廣泛應(yīng)用于應(yīng)用于飼料生產(chǎn)行業(yè)，其在醫(yī)藥、食品、化妝品行業(yè)的應(yīng)用前景也非常廣闊。在工業(yè)生產(chǎn)方面，人們主要利用化學(xué)法和微生物法進(jìn)行煙酰胺生產(chǎn)。煙酰胺的微生物生產(chǎn)法有著化學(xué)法無法比擬的優(yōu)越性，此方法對(duì)環(huán)境幾乎不造成污染，且生產(chǎn)成本低，工藝簡(jiǎn)便。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌種HD1220為出發(fā)菌株，分別使用ARTP誘變、微波誘變、E

2、MS誘變?nèi)N單因子誘變以及在各因子最佳誘變條件下的復(fù)合誘變，確定了復(fù)合誘變的最佳條件為：ARTP誘變時(shí)間240 s；微波誘變強(qiáng)度60％，微波照射時(shí)間90 s，；EMS濃度0.8%。誘變完成后，篩選出一株能夠穩(wěn)定遺傳且酶活高達(dá)1764 U/mL的高腈水合酶活性菌株，與出發(fā)菌株相比，誘變后菌株酶活提高了33.13%，并將該菌株暫時(shí)命名為NHD-1。⑵利用HPLC對(duì)煙酰胺進(jìn)行檢測(cè)，通過對(duì)HPLC檢測(cè)的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相流量、流動(dòng)相比例三個(gè)條

3、件進(jìn)行的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最終確定HPLC檢測(cè)煙酰胺的各個(gè)最優(yōu)條件為：紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，流動(dòng)相的流量為0.4 mL/min，流動(dòng)相中甲醇：水=1：3。在以上條件下，煙酰胺出峰時(shí)間為5.306 min，與條件優(yōu)化前相比，煙酰胺出峰時(shí)間明顯縮短。⑶對(duì)腈水合酶參與煙酰胺生產(chǎn)過程中酶催化反應(yīng)條件進(jìn)行單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，我們得出各因素的最佳條件為：菌體濃度1.8%，菌齡48 h，底物濃度100 g/L，溫度29℃，pH7，反應(yīng)時(shí)間180 mi

4、n，在實(shí)際發(fā)酵后期應(yīng)該對(duì)產(chǎn)物煙酰胺進(jìn)行及時(shí)分離。通過Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)我們分析出底物濃度、溫度和pH這三個(gè)因素對(duì)腈水合酶的酶活有及其顯著的影響；通過對(duì)這三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，我們得出了這三個(gè)因素的最佳條件組合為底物濃度98.88 g/L，反應(yīng)溫度29.10℃，pH值7.14。在此條件下酶活響應(yīng)值為1784 U/mL。對(duì)SAS軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到腈水合酶的實(shí)際酶活為1775U/mL，與多元回歸分