結(jié)腸化生Paneth細(xì)胞通過(guò)TLR4通路調(diào)節(jié)IL23-Th17軸在炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、目的:
　　炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD）是一種非特異性炎癥性疾病，與自身免疫異常有關(guān)，是西方國(guó)家常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病，在普通人群中的發(fā)病率接近0.2％。近年來(lái)，隨著生活方式的西化，我國(guó)IBD的發(fā)病率明顯上升，特別是在北京、上海等經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，IBD的發(fā)病率已逐漸接近歐美國(guó)家水平，其中潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)的發(fā)病率要明顯高于克羅恩病(Crohn's Di

2、sease，CD)，在我國(guó)兩者的發(fā)病率接近10∶1。IBD作為一組特發(fā)性慢性腸道炎性疾病，目前多進(jìn)行對(duì)癥性治療，暫無(wú)根治手段，臨床表現(xiàn)差異性較大，易復(fù)發(fā)，并發(fā)癥較重，腸外表現(xiàn)復(fù)雜多樣。研究表明接近30-60％的IBD患者在疾病發(fā)展過(guò)程中必須接受外科治療，患者生活質(zhì)量受到極大影響，而且，IBD已成為中國(guó)下消化道大出血最常見(jiàn)的病因之一，嚴(yán)重影響患者的生命安全。另外，IBD還存在一定的癌變風(fēng)險(xiǎn)，因此IBD一直是消化系統(tǒng)疾病的研究熱點(diǎn)之一。

3、r>　　目前，IBD的確切病因尚不清楚，但基礎(chǔ)和臨床研究均提示腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞及腸道微生物引發(fā)異常炎癥反應(yīng)在IBD發(fā)病中具有重要作用，長(zhǎng)期的慢性炎癥狀態(tài)可能是炎癥因子過(guò)度分泌或者關(guān)鍵負(fù)性調(diào)節(jié)途徑缺陷的結(jié)果。在生理情況下，Paneth細(xì)胞主要分布于小腸，可分泌大量抗菌顆粒，抵抗腸道微生物的侵襲，是腸道天然免疫的重要效應(yīng)器。在慢性炎癥狀態(tài)下，結(jié)腸可出現(xiàn)Paneth細(xì)胞化生，但是結(jié)腸化生的Paneth細(xì)胞功能的相關(guān)研究極少，Paneth細(xì)

4、胞在IBD發(fā)病中的作用機(jī)制尚值得進(jìn)一步探討。最新研究證據(jù)表明，白介素23(IL-23)/Th17途徑是腸道炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一，腸道炎癥時(shí)IL-23在腸道的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在全身的表達(dá)，具有明顯的組織特異性，因此IL-23在IBD發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中扮演著重要的角色。而研究發(fā)現(xiàn)TLR4通路參與調(diào)控IL-23/Th17軸的活化過(guò)程，而Paneth細(xì)胞又可表達(dá)TLR，因此，Paneth細(xì)胞通過(guò)TLR4通路進(jìn)而調(diào)控IL-23/Th17軸可能是其參

5、與IBD發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一，本研究通過(guò)對(duì)人體標(biāo)本的檢測(cè)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這一假說(shuō)，以進(jìn)一步明確炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分:內(nèi)鏡下采集潰瘍性結(jié)腸炎患者病變結(jié)腸組織并進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，以進(jìn)一步明確Paneth細(xì)胞化生及TLR4表達(dá)與IBD發(fā)生的相關(guān)性。并對(duì)標(biāo)本量充足的潰瘍性結(jié)腸炎病變結(jié)腸組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，檢測(cè)其中IL23、IL17等炎癥因子水平，評(píng)估其在IBD發(fā)生過(guò)程中所發(fā)揮的重要作用及其是否與Paneth

6、細(xì)胞化生及TLR4表達(dá)升高存在相關(guān)性。
　　第二部分:建造DSS小鼠炎癥性腸病模型，通過(guò)觀察其體重變化、飲食、大便性狀、大便潛血等進(jìn)行病情活動(dòng)度評(píng)分，并采集新鮮病變標(biāo)本，通過(guò)HE染色、免疫組化檢測(cè)、RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)等方法檢測(cè)IBD組織中Paneth細(xì)胞化生、TLR4及IL23、IL17等表達(dá)的變化，以探討上述因素在IBD發(fā)病過(guò)程中的作用。
　　第三部分:建立炎癥性腸病小鼠模型

7、，并給予TLR4激動(dòng)劑LPS，進(jìn)行病情活動(dòng)度評(píng)分，并采集新鮮病變標(biāo)本，通過(guò)HE染色、免疫組化檢測(cè)、RT-PCR及ELISA等方法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中Paneth細(xì)胞化生、TLR4及IL23、IL17等表達(dá)的變化，進(jìn)一步明確TLR4在炎癥性腸病發(fā)生和進(jìn)展中的作用。另外，通過(guò)給予TLR4阻斷劑TAK242，觀察是否可以減輕炎癥性腸病小鼠的病情及上述指標(biāo)的異常程度，反向證實(shí)TLR4對(duì)炎癥性腸病發(fā)生發(fā)展的重要影響。
　　第四部分:通過(guò)使用P

8、aneth細(xì)胞特異性速效阻斷劑雙硫腙在體阻斷炎癥性腸病動(dòng)物模型的Paneth細(xì)胞，以進(jìn)一步明確其在炎癥性腸病發(fā)病過(guò)程中的重要作用和診斷價(jià)值，并初步探討其對(duì)TLR4信號(hào)通路的調(diào)控作用及這種調(diào)控作用對(duì)IL23/Th17軸在炎癥性腸病發(fā)生過(guò)程中作用的影響。
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　潰瘍性結(jié)腸炎患者病變結(jié)腸組織存在明顯的Paneth細(xì)胞化生和TLR4通路高表達(dá)，且二者之間存在相關(guān)性。
　　潰瘍性結(jié)腸炎患者病變結(jié)腸

9、組織存在明顯的IL23/Th17軸的活化。
　　潰瘍性結(jié)腸炎患者病變結(jié)腸組織Paneth細(xì)胞化生和TLR4通路高表達(dá)與IL23/Th17軸的活化存在明顯相關(guān)性。
　　第二部分:
　　DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病小鼠癥狀、病理及MPO活性改變等類(lèi)似人炎癥性腸病表現(xiàn)。
　　DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病小鼠病變結(jié)腸部位出現(xiàn)明顯的Paneth細(xì)胞化生及TLR4表達(dá)升高，炎癥因子IL23、IL17和IL6的分泌水平亦明顯升高，提示上述

10、因素可能與炎癥性腸病的發(fā)生密切相關(guān)。
　　第三部分:
　　給予TLR4激活劑LPS，炎癥性腸病小鼠病情加重，DAI評(píng)分升高，病變結(jié)腸MPO活性明顯升高，并出現(xiàn)明顯的Paneth細(xì)胞化生及TLR4表達(dá)升高。炎癥因子IL23、IL17和IL6的分泌水平明顯高于普通模型組。
　　給予TLR4阻斷劑TAK242，炎癥性腸病小鼠病情減輕，DAI評(píng)分降低，病變結(jié)腸MPO活性亦明顯降低，炎癥因子IL23、IL17和IL6的分泌水平低

11、于普通模型組。
　　上述結(jié)果從正反兩個(gè)方向提示TLR4通路可能通過(guò)調(diào)控IL23/Th17軸的活化進(jìn)而在炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　另外，給予TLR4阻斷劑后，在Paneth細(xì)胞化生仍然存在的情況下，DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病小鼠病情減輕，提示Paneth細(xì)胞化生在炎癥性腸病發(fā)生發(fā)展的重要作用可能主要是通過(guò)TLR4通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　第四部分:
　　給予Paneth細(xì)胞阻斷劑雙硫腙，炎癥性腸病小鼠病情減輕

12、，DAI評(píng)分降低，病變結(jié)腸MPO活性明顯下降，TLR4表達(dá)亦有明顯下降。炎癥因子IL23、IL17和IL6的分泌水平明顯低于普通模型組。
　　給予Paneth細(xì)胞阻斷劑雙硫腙后，即使再次給予TLR4激活劑LPS，炎癥性腸病小鼠病情也明顯輕于DL組，甚至普通模型組，DAI評(píng)分降低，病變結(jié)腸MPO活性亦明顯降低，炎癥因子IL23、IL17和IL6的分泌水平低于DL組。
　　上述結(jié)果從正反兩個(gè)方向提示Paneth細(xì)胞化生在炎癥性腸

13、病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，化生Paneth細(xì)胞可能通過(guò)TLR4通路調(diào)控IL23/Th17軸進(jìn)而影響炎癥性腸病進(jìn)展。
　　結(jié)論:
　　本研究通過(guò)對(duì)炎癥性腸病患者病變結(jié)腸組織的檢測(cè)及對(duì)炎癥性腸病動(dòng)物模型的干預(yù)發(fā)現(xiàn)炎癥性腸病組織存在明顯的Paneth細(xì)胞化生和TLR4通路高表達(dá)與IL23/Th17軸的活化，且三者之間存在明顯相關(guān)性;化生Paneth細(xì)胞可能通過(guò)TLR4通路調(diào)控IL23/Th17軸的活化水平進(jìn)而影響炎癥性腸病進(jìn)展