擬南芥細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因ATR介導(dǎo)的鋁毒引起的根生長抑制機(jī)制研究.pdf

1、酸性土壤占世界耕地面積的30％以上，而鋁毒是酸性土壤中限制作物生長最主要的因素。大量研究表明，鋁可以與細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)組分等多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行相互作用，但是鋁與哪些位點(diǎn)作用是導(dǎo)致鋁毒害最主要的原因目前還存在爭議。之前的研究發(fā)現(xiàn)，ATR基因的突變可以增強(qiáng)對(duì)鋁毒的抗性，并且能夠挽救als3突變體對(duì)鋁毒的敏感性。ATR的主要功能是負(fù)責(zé)監(jiān)測DNA單鏈和復(fù)制叉損傷，然后通過激活細(xì)胞周期開關(guān)機(jī)制來阻礙細(xì)胞周期進(jìn)入下一個(gè)階段，從而讓細(xì)胞有時(shí)間對(duì)損傷D

2、NA進(jìn)行修復(fù)，保證基因組的完整性。在atr突變體中由于不對(duì)鋁毒產(chǎn)生的DNA損傷進(jìn)行應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞分裂和根生長不受抑制，從而導(dǎo)致突變體更抗鋁毒。同時(shí)該研究結(jié)果也認(rèn)為，鋁引起的DNA損傷是鋁毒害的主要機(jī)制，但是該假說并不能充分解析之前的其它鋁毒害現(xiàn)象和機(jī)制。
　　為了進(jìn)一步探究atr的抗鋁毒機(jī)制，本研究選取了5個(gè)對(duì)鋁毒敏感的突變體als3、star1、stop1、almt1、als1，分別與atr突變體進(jìn)行雜交構(gòu)建雙突變體材料，然后分

3、析各雙突變體的抗鋁毒表型，揭示atr與各鋁毒敏感突變體在遺傳上的上下游關(guān)系，并探明atr在挽救鋁毒敏感突變體表型上的作用機(jī)制，主要結(jié)果如下:
　　(1)基于根生長的抗鋁毒表型實(shí)驗(yàn)揭示atr不僅能恢復(fù)als3對(duì)鋁毒的抗性，而且能恢復(fù)star1對(duì)鋁毒的抗性。Evans blue染色表明雙突變體的細(xì)胞質(zhì)膜損傷程度降低，證明atr能夠恢復(fù)對(duì)als3、star1對(duì)鋁毒的抗性。但是通過對(duì)雙突變體star1 atr中鋁含量的測量發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的鋁

4、積累并沒有減少，而且熒、光定量PCR表明star1atr中抗鋁毒基因的表達(dá)也與野生型無異，表明atr并不通過主動(dòng)排鋁或者上調(diào)抗鋁毒機(jī)制來恢復(fù)als3、star1對(duì)鋁毒的抗性。因?yàn)閍tr的修復(fù)作用對(duì)als3和star1都起作用,star1 als3雙突變體與star1、als3單突變體對(duì)鋁毒的敏感性一樣，并沒有表現(xiàn)累加效應(yīng)，atr能將雙突變體star1 als3對(duì)鋁毒的抗性恢復(fù)到野生型水平，進(jìn)一步間接驗(yàn)證了ALS3和STAR1可以相互作用

5、，而且位于同一個(gè)通路上。
　　(2)通過測量相對(duì)根長實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在加鋁條件下almt1atr、stop1atr根長與單突變體almt1、stop1無異，說明atr不能恢復(fù)almt1、stop1對(duì)鋁毒的抗性。Evans blue染色揭示雙突變體almt1atr、stop1atr的細(xì)胞質(zhì)膜損傷程度較大，與almt1、stop1相比沒有絲毫減輕，這也佐證了atr不能挽救almt1、stop1對(duì)鋁毒的敏感性的結(jié)論。采用 ICP-MS對(duì)各材料的

6、鋁含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)雙突變體almt1atr、stop1atr與相應(yīng)單突變體almt1、stop1中鋁含量沒有差異，這與atr不能改變almt1、stop1的鋁毒敏感表型一致。ALMT1主要通過轉(zhuǎn)運(yùn)蘋果酸到細(xì)胞外進(jìn)行螯合和解除鋁毒，而STOP1主要通過調(diào)控ALMT1的表達(dá)來介導(dǎo)對(duì)鋁毒的抗性，因此ALMT1和STOP1主要采用外部解鋁毒機(jī)制進(jìn)行抗鋁毒。atr不能恢復(fù)almt1、stop1對(duì)鋁毒的抗性提示atr對(duì)外部解鋁毒機(jī)制缺陷的植株不能

7、恢復(fù)其對(duì)鋁毒的抗性。
　　(3)抗鋁毒根生長表型分析和Evans blue染色實(shí)驗(yàn)都表明atr能恢復(fù)als1對(duì)鋁毒的抗性。ALS1編碼一個(gè)定位液泡膜的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它主要負(fù)責(zé)將細(xì)胞質(zhì)的鋁隔離到液泡中。因此，該研究結(jié)果提示atr對(duì)細(xì)胞內(nèi)部解毒機(jī)制缺陷能夠進(jìn)行挽救，另外還提示als1對(duì)鋁毒的敏感性可能主要由于DNA損傷引起。
　　(4)綜合以上遺傳分析和抗鋁毒表型分析結(jié)果，我們認(rèn)為atr可以緩解細(xì)胞內(nèi)部鋁毒引起的傷害，但不能減