神經(jīng)發(fā)生在大鼠垂體切除后中樞性尿崩癥的研究.pdf

1、研究背景:
　　哺乳動物的下丘腦神經(jīng)垂體束(Hypothalamo-neurohypophyseal Tract)由下丘腦室旁核（Paraventricular hypothalamic Nucleus，PVN）和視上核(SupraopticNucleus，SON)大細胞神經(jīng)元發(fā)出的神經(jīng)軸突形成，軸突延伸至垂體后葉，主要有合成、轉(zhuǎn)運和釋放大細胞神經(jīng)元分泌的精氨酸加壓素(Arginine Vasporessin，AVP)和催產(chǎn)素(O

2、xytocin，OT)的功能。而缺乏精氨酸加壓素則會出現(xiàn)尿量增多、尿比重減少、多飲等癥狀。下丘腦神經(jīng)垂體系統(tǒng)的垂體束損傷方式一般可以通過切除垂體來達到造模目的，常用的手術(shù)入路有咽旁入路和經(jīng)耳入路，而咽旁人路因為對動物損傷大，術(shù)后并發(fā)癥多，術(shù)后長期存活率較低的缺點，不適合長期觀察實驗，所以擬使用經(jīng)耳入路，而立體定向下經(jīng)耳入路為方便快捷的造模方法，術(shù)后恢復(fù)快，存活率較高，但是也具有不能全切除垂體和造模率低的缺點，而同時也有對動物大小有限制，

3、為了穩(wěn)定造模成功率，迫切需要探求適合手術(shù)的動物。垂體切除術(shù)后的一系列復(fù)雜的病理生理改變?nèi)匀恍枰粩嗟奶剿?，不少學(xué)者認(rèn)為是由于下丘腦神經(jīng)垂體的系統(tǒng)(Hypothalamo-neurohypophyseal System，HNS)損傷后，導(dǎo)致下丘腦的大細胞神經(jīng)元的逆行性退變，最終因為分泌激素減少產(chǎn)生中樞性尿崩癥。同時也有不少研究提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷的可能伴隨新生細胞，而部分新生細胞通過一段時間的生長后會分化并成熟為神經(jīng)元，并具有神經(jīng)元表達

4、的蛋白和功能。然而并未確切報道證實垂體切除模型中下丘腦室旁核或視上核是否有神經(jīng)發(fā)生，而新生細胞是否并具有釋放激素功能以及新生神經(jīng)元與中樞性尿崩癥的關(guān)系進行進一步闡述。神經(jīng)發(fā)生為神經(jīng)前體細胞產(chǎn)生具有功能的神經(jīng)元的一個過程，近幾十年來越來越多的證據(jù)表明成年哺乳動物腦中存在神經(jīng)干細胞，能增值和分化為新的神經(jīng)元，具有功能性并整合到成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，成年動物腦內(nèi)存在神經(jīng)干細胞的意義尚不太清楚，可能與其通過不斷的自我更新、遷移和分化來補充因疾病、

5、損傷或凋亡而丟失的神經(jīng)細胞，以維持腦功能的可塑性有關(guān)?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為至少在兩個腦區(qū)存在神經(jīng)發(fā)生，即側(cè)腦室的室管膜下區(qū)(Subventricular Zone，SVZ)和海馬齒狀回的顆粒下層(Subgranular Zone，SGZ)。另外在黑質(zhì)、杏仁核、皮層、紋狀體等區(qū)域均有散在的神經(jīng)發(fā)生。而最近的研究發(fā)現(xiàn)在下丘腦也可能存在神經(jīng)發(fā)生。我們推想在去垂體大鼠模型中，神經(jīng)元的逆行性退變是否會同時引起同類神經(jīng)元的重新補充，其新生神經(jīng)元的起源位置是

6、否在下丘腦附近，是否與中樞性尿崩癥都有待研究證實。探索闡明垂體切除術(shù)后是否有神經(jīng)發(fā)生，對神經(jīng)修復(fù)的研究有重要意義，也對以后的臨床治療提供新的思路?；谝陨峡紤]，我們通過使用立體定向儀行大鼠垂體切除術(shù)，并描述對術(shù)后大鼠的中樞性尿崩的規(guī)律，找到適合觀察的時間點，同時利用新生細胞標(biāo)記方法，追蹤觀察術(shù)后大鼠下丘腦內(nèi)視上核與室旁核是否存在新生細胞，以及對新生細胞進行定性，探討神經(jīng)發(fā)生在垂體切除模型中的規(guī)律。
　　研究目的:
　　1.使

7、用立體定向儀去除不同體重范圍的大鼠垂體，以建立穩(wěn)定的立體定向去垂體大鼠模型，并觀察術(shù)后中樞性尿崩的變化特征，尋找適宜觀察神經(jīng)發(fā)生的時間窗;
　　2.在不同時間段觀察大鼠去垂體術(shù)后下丘腦視上核、室旁核區(qū)域是否出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)生，并觀察其成熟及存活情況;
　　研究方法:
　　第一部分立體定向下大鼠垂體切除術(shù)模型及中樞性尿崩的觀察
　　1.造模方法:利用立體定向儀經(jīng)耳入路行大鼠垂體切除。
　　2.實驗分組:實驗一:雄性

8、SD大鼠共60只，體重150-200g15只，200-250g15只，250-300g15只，300-450g15只。實驗二:選用150-250g大鼠，垂體切除組12只，假手術(shù)組10只;
　　3.記錄術(shù)后3天內(nèi)出現(xiàn)尿崩的大鼠數(shù)量，以術(shù)后尿量大于空手術(shù)組的2倍，尿色清亮為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計比較各組術(shù)后尿崩的發(fā)生率;
　　4.記錄各組術(shù)后短期存活天數(shù)（5天）以及長期存活天數(shù)（30天）大鼠數(shù)量，統(tǒng)計比較各組術(shù)后短期長期存活率;
　　

9、5.術(shù)后解剖觀察垂體窩是否有殘存，統(tǒng)計各組立體定向下的全切率;
　　6.術(shù)后測定大鼠的中樞性尿崩癥的生物學(xué)特性的變化:每日測尿量、尿比重、攝水量，并繪制尿崩曲線;
　　7.數(shù)據(jù)處理:用SPSS20.0作統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用卡方檢驗、方差分析、重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析以及各時間點單獨效應(yīng)的比較(LSD方法)，以P＜0.05表示有顯著性差異。
　　第二部分大鼠去垂體術(shù)后不同時期下丘腦新生AVP神經(jīng)元的情況<

10、br>　　1.造模及分組:造模跟第一部分一致，分組:雄性SD大鼠18只，隨機分為空手術(shù)組6只，術(shù)后10天組6只，術(shù)后20天組6只。
　　2.BrdU標(biāo)記:術(shù)后每只大鼠每天每次腹腔注射100mg/kg的BrdU，連續(xù)7天;
　　3.灌注取腦及免疫熒光檢測:假手術(shù)組和垂體切除術(shù)后10天組于第10天灌注處死、20天組于術(shù)后第20天灌注處死，用生理鹽水和冰凍4％多聚甲醛心尖灌注取腦后，進行蔗糖梯度脫水，腦組織沉底后，用冰凍切片包埋劑

11、包埋，連續(xù)切冠狀位片，做成漂片放置4度冰箱保存。視上核與室旁核BrdU染色:漂洗腦片后經(jīng)鹽酸酸化和四硼酸鈉中和，用5％BSA室溫封閉2h，用小鼠抗BrdU抗體1∶800孵育，4度過夜，漂洗后用熒光二抗488避光孵育，隔日避光PBS-T漂洗，避光孵育DAPI，滴防熒光淬滅劑熒光顯微鏡下觀察。BrdU/AVP免疫共染色:漂洗后用5％BSA封閉，用兔抗AVP抗體1∶2000孵育，4度過夜，漂洗后用熒光二抗546避光孵育，避光孵育DAPI后用甲

12、醇固定，漂洗后經(jīng)鹽酸酸化和四硼酸鈉中和后，用小鼠抗BrdU抗體1∶800孵育，4度過夜，漂洗后用熒光二抗488避光孵育，滴防熒光淬滅劑熒光顯微鏡下觀察.
　　4.熒光顯微鏡下各組取6張間隔腦片拍照，并計數(shù)各組BrdU陽性細胞數(shù)、AVP陽性細胞數(shù)、BrdU與AVP共同陽性表達細胞數(shù)。
　　5.數(shù)據(jù)處理:用SPSS20.0作統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用卡方檢驗、方差分析，以P＜0.05表示有顯著性差異。
　　研

13、究結(jié)果:
　　1.立體定向下經(jīng)耳行大鼠垂體切除術(shù)，術(shù)后各組短期（5天）存活率和長期(30天)存活率各組之間無明顯差異。各組尿崩發(fā)生率、全切除率無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.立體定向大鼠垂體切除術(shù)后出現(xiàn)中樞性尿崩，經(jīng)統(tǒng)計檢驗?zāi)虮罃?shù)據(jù)可劃分為小于47.5ml/24h與高于47.5ml/24h兩個范圍，將波動趨勢曲線被劃分為3部分，分別為術(shù)后第1天至第6天、第7天至第11天、第12天至20天。呈三相型尿崩。術(shù)后第1天到第6天為急性期，尿

14、量、攝水量急劇升高、尿比重下降，此期尿量均值為56.4±18.9ml/24h，攝水量為63.9±27.5ml/24h，緊接著會出現(xiàn)1天或數(shù)天尿量、攝水量下降、尿比重上升的間歇期尿量、攝水量分別為40.8±12.3ml/24h，57.2±31.2ml/24h，之后尿量、攝水量重新上升，然后緩慢下降維持到一定水平的持續(xù)期，尿量、攝水量均值分別為61.1±16.5ml，63.6±30.2ml/24h，而尿比重反復(fù)波動，急性期降至1.018±0

15、.109、間歇期1.026±0.008與空手術(shù)組無明顯差異、持續(xù)期為1.019±0.11。
　　3.術(shù)后10天、20天觀察到大鼠下丘腦視上核與室旁核內(nèi)出現(xiàn)新生細胞，以視上核區(qū)域出現(xiàn)較多。10天組視上核的BrdU陽性細胞數(shù)為552.7±247.9個對比20天（449.5±217.3個）無明顯統(tǒng)計學(xué)差，10天組的BrdU陽性細胞數(shù)為117.6±66.2個對比20天組63.7±45.3個也無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。
　　4.10天組中視上

16、核表達AVP的BrdU為113±61.1個與20天組（130±65.8個）比較無統(tǒng)計學(xué)差異。而在室旁核上，術(shù)后10天組的免疫共染雙陽性的細胞數(shù)為34.8±27.6個對比20天組22.8±16.3個無統(tǒng)計學(xué)差異，而10天組的視上核與室旁核相比，有統(tǒng)計學(xué)意義。提示術(shù)后一段時間后視上核與室旁核的新生細胞有部分可分化成熟為為表達AVP的神經(jīng)元，以視上核區(qū)域較多，而術(shù)后20天視上核的新生AVP神經(jīng)元占總AVP神經(jīng)元比例較視上核術(shù)后10天組較大。<

17、br>　　5.10天組的6只大鼠視上核陽性細胞合計總數(shù)為11694個，6只大鼠BrdU與AVP共染雙陽性細胞總數(shù)為678個，陽性率為5.8％;20天組6只大鼠視上核陽性細胞總數(shù)為6324個，6只大鼠BrdU與AVP共染雙陽性細胞總數(shù)為781個，陽性率為12.3％。x2=246.38，P＜0.01，提示20天組的視上核新生的AVP細胞占分泌AVP細胞的比例比10天組要高。而在室旁核10天組與20天組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　研究結(jié)論: