2型糖尿病腎病大鼠模型的建立及慢病毒載體介導(dǎo)siRNA對(duì)I型膠原抑制作用的研究.pdf

1、腎臟纖維化是糖尿病腎病等慢性腎臟疾病終末期的病理變化特征，其本質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度積聚，其中Ⅰ型膠原的過(guò)度表達(dá)在該過(guò)程中起到重要作用。利用RNA干涉技術(shù)下調(diào)Ⅰ型膠原基因的過(guò)度表達(dá)，以期成為延緩腎臟纖維化的新方法。
　　 第一部分2 型糖尿病腎病大鼠模型的建立
　　 目的：在原有高糖高脂飲食+鏈脲佐菌素（STZ）造模方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步縮短造模時(shí)間，優(yōu)化模型，使模型更加接近于人類2 型糖尿病腎臟病，為探索其機(jī)制及治療方法提供

2、一個(gè)更好的動(dòng)物模型。方法：4周的雄性SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組（A組，n=15）和模型組（B組，n=15）。A組為普通飲食，B組采用高糖高脂飼料＋5％葡萄糖飲水喂養(yǎng)，誘發(fā)胰島素抵抗，2周后，按照30mg/kg的劑量腹腔注射STZ，連續(xù)注射3天，誘發(fā)持續(xù)高糖血癥，繼續(xù)觀察6周。每2周測(cè)定大鼠的體質(zhì)量、尿蛋白及尿白蛋白排泄率、血糖，實(shí)驗(yàn)及注射STZ 前、注射6周后采集血樣，測(cè)血肌酐、血尿素氮及血胰島素。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)前2組大鼠的體質(zhì)量、血糖、血胰

3、島素、血肌酐和尿素氮無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。高糖高脂飼料+5％葡萄糖飲水2周后，B組血胰島素較A組有明顯的升高（P＜0.01），完成STZ 注射24h后，B組血糖有明顯升高(P＜0.01)。其腎臟改變特點(diǎn)，臨床上表現(xiàn)為持續(xù)蛋白尿，病理改變?yōu)橄的ぜ?xì)胞增生、系膜區(qū)基質(zhì)增多。結(jié)論：高糖高脂飼料+5％葡萄糖飲水+連續(xù)小劑量STZ 可建立理想的2 型糖尿病腎病大鼠模型，該模型具有人類2 型糖尿病腎病的主要表型特征和相似的發(fā)病過(guò)程，且造模時(shí)間

4、相對(duì)縮短。
　　 第二部分I 型膠原慢病毒干擾載體的構(gòu)建及其在糖尿病腎病大鼠腎臟轉(zhuǎn)染的研究
　　 目的：在體外構(gòu)建并篩選出靶向I型膠原的有效RNA 干擾慢病毒載體，研究其在活體糖尿病腎病大鼠腎臟的基因轉(zhuǎn)染及表達(dá)情況。方法：設(shè)計(jì)3條siRNA 序列并合成雙鏈DNAoligo，制備目的基因RNA 干擾慢病毒載體，體外感染目的細(xì)胞，利用RT-PCR的方法檢測(cè)目的基因I型膠原的表達(dá)情況，從而篩選出有效的干擾靶點(diǎn)。經(jīng)腎動(dòng)脈注射I型

5、膠原慢病毒干擾載體，在注射后第15天處死大鼠，觀察綠色熒光檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)。結(jié)果：酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果均提示siRNA 序列成功連接入載體中。RT-PCR結(jié)果提示1號(hào)靶點(diǎn)的干擾效率最高，達(dá)到77％左右。腎臟組織可觀察到綠色熒光。結(jié)論：I型膠原靶向RNA 干擾慢病毒載體構(gòu)建成功，能有效抑制目的細(xì)胞中I型膠原的表達(dá)且有效而穩(wěn)定的將外源基因?qū)牖铙w大鼠腎臟。
　　 第三部分慢病毒載體介導(dǎo)siRNA對(duì)糖尿病腎病大鼠I型膠原抑制作用的研究

6、
　　 目的：分析I型膠原慢病毒干擾載體對(duì)糖尿病腎病大鼠體內(nèi)抑制I型膠原的效果；
　　 方法：14只雄性患有糖尿病腎病Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為三組：A組為I型膠原慢病毒干擾載體干涉組（n=6）；B組為空病毒對(duì)照組（n=6）；C組為空白對(duì)照組（n=2）。
　　 利用腎動(dòng)脈注射方法，每只I型膠原慢病毒干擾載體干涉組及空病毒對(duì)照組糖尿病腎病大鼠分別注射I型膠原慢病毒干擾載體、空病毒200ul、空白組注射

7、等量生理鹽水。
　　 大鼠在注射后兩周處死，取得腎臟。用熒光定量PCR和免疫組化Western blot分別檢測(cè)I型膠原mRNA和蛋白表達(dá)量的改變，驗(yàn)證所設(shè)計(jì)的I型膠原慢病毒干擾載體的抑制效應(yīng)。
　　 結(jié)果：與空病毒組及空白組比較， I型膠原慢病毒干擾載體組mRNA表達(dá)分別下調(diào)38-48％（P＜0.05)，蛋白表達(dá)分別下調(diào)10-22％（P＜0.05)，空病毒組與空白組比較無(wú)差別。
　　 結(jié)論：I型膠原慢病毒干擾載