上調(diào)表達ChM-I的大鼠MSCs向軟骨細胞分化的研究.pdf

1、研究目的:探索ChM-Ⅰ的上調(diào)表達誘導MSCs向軟骨細胞方向分化的作用。
　　 研究方法:
　　 1.密度梯度離心法獲得大鼠MSCs，傳代培養(yǎng)并擴增。使用流式細胞儀檢測細胞表面抗原(CD90、CD29)。將凍存的穩(wěn)轉(zhuǎn)pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ質(zhì)粒的MSCs和穩(wěn)轉(zhuǎn)pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的MSCs復蘇及擴培。
　　 2.高糖DMEM無血清特定培養(yǎng)誘導液（含10ng/mlTGF-β1、100nmol/L地塞

2、米松、50umol/ml抗壞血酸、1％ITS）
　　 3.實驗分六組(1):實驗1組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達載體pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ的MSCs細胞組）(2):實驗2組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達載體pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ的MSCs細胞+誘導液組）(3):對照1組（正常MSCs組）(4):對照2組（正常MSCs+誘導液組）(5):對照3組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達載體pcDNA3.1(+)的MSCs細胞組）(6):對照4組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達載體

3、pcDNA3.1(+)的MSCs+誘導液組），細胞培養(yǎng)至7天、14天、21天三個時間點，通過使用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的改變;甲苯胺藍染色檢測軟骨基質(zhì)的分泌情況;免疫細胞化學檢測軟骨特異性Ⅱ型膠原的表達情況。通過以上實驗方法說明表達ChM-Ⅰ的大鼠MSCs細胞株具有向軟骨細胞分化的能力。
　　 研究結果:
　　 1.MSCs細胞株的擴增培養(yǎng)及鑒定:
　　 單細胞懸液接種48h后換液，倒置顯微鏡觀察并拍照:可于培養(yǎng)

4、皿底部見到呈梭形或三角形的貼壁細胞，培養(yǎng)11～13天后培養(yǎng)皿底部細胞密度達到85％以上。通過傳代，細胞在6h內(nèi)可達80％以上貼壁，細胞生長速度加快，可見細胞呈成纖維細胞樣生長，折光性較強，群落呈魚群樣。流式細胞儀鑒定結果:MSCs陽性表面抗原CD90、CD29的表達率分別為99.79％、98.41％;MSCs陰性表面抗原CD45、CD11b/c的表達率分別為2.77％、2.51％。提示MSCs達到實驗要求。
　　 2.凍存的穩(wěn)定

5、轉(zhuǎn)染表達載體pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ的MSCs細胞組和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達載體pcDNA3.1(+)的MSCs細胞組復蘇及擴培:常規(guī)復蘇后，通過增值、傳代，細胞生長旺盛，排列密集整齊，呈編織狀、旋渦狀。
　　 3.六組細胞甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫組化結果及分析:
　　 實驗2組誘導后的細胞和3個對照組的細胞由梭形向多邊形轉(zhuǎn)變。甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫組化結果顯示:對照1、3組檢測的特異性軟骨基質(zhì)的分泌和軟骨Ⅱ型膠原

6、的表達均為陰性;實驗1組和對照2、4組均檢測存在特異性軟骨基質(zhì)的分泌和軟骨型Ⅱ膠原的表達，但實驗1組為弱陽性，對照2、4組為陽性，說明ChM-Ⅰ的上調(diào)表達可誘導MSCs向軟骨細胞分化，但不及TGF-β1的效率;實驗2組檢測軟骨基質(zhì)的分泌和軟骨Ⅱ型膠原的表達呈強陽性，優(yōu)于對照2、4組;實驗2組和實驗1組均能檢測到特異性軟骨基質(zhì)的分泌和軟骨Ⅱ型膠原的表達，且實驗2組優(yōu)于實驗1組;說明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達載體pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ的MSC