馬氏副球菌W10173基因組測序及其酰胺酶基因的克隆與表達.pdf

1、酰胺酶可以將酰胺水解生成對應的羧酸和氨，在醫(yī)藥、食品、紡織皮革加工等方面具有極其重要的作用。L-天冬酰胺酶廣泛被臨床上用于兒童急性淋巴細胞白血?。ˋLL）的治療；L-谷氨酰胺酶在谷氨酰胺分解過程中是關鍵酶和限速酶，與腫瘤的生長、腫瘤血管的生成及腫瘤免疫都有重要的關系；立體專一性哌嗪-2-甲酰胺酶可以催化水解產(chǎn)生一種手性藥物中間體哌嗪-2-羧酸，其不同的單一對映體（R型和S型）衍生物具有多種不同的藥理學活性。本實驗室在前期工作中篩選得到的

2、馬氏副球菌(Paracoccus marcusii)W10173可立體選擇性水解(R,S)-哌嗪-2-甲酰胺中的(S)-哌嗪-2-甲酰胺得到(S)-哌嗪-2-羧酸，本實驗通過基因組測序技術獲得馬氏副球菌W10173基因組，為了進一步發(fā)掘菌株本身酰胺酶資源，分析得到5個酰胺酶基因并對其進行克隆及異源表達，為酰胺酶的生產(chǎn)和應用提供基礎。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴通過分析基因組測序，馬氏副球菌W10173編碼1個谷氨酰胺酶(PM150

3、9)、2個天冬酰胺酶(PM1383, PM3012)和2個潛在的哌嗪-2-甲酰胺酶(PM2486, PM3475)。PM1509, PM1383和PM3012成功克隆并構建pET28-a(+)-X/BL21(DE3)原核重組表達載體，以IPTG為誘導劑，當OD600約為0.6時，加入0.8 mmol/L IPTG，18℃誘導5 h，目的蛋白的表達量分別占蛋白表達總量的30.5％,23.8%,20.3%。但目的蛋白都以包涵體形式存在，經(jīng)超

4、聲破碎處理后將包涵體蛋白用Ni柱試劑盒純化，純化后蛋白的表達量分別為2.53 mg/mL,2.13 mg/mL,1.62 mg/mL，純化蛋白復性后蛋白的表達量分別為0.41 mg/mL,0.34 mg/mL,0.31 mg/mL，收率分別為16.2%,15.9%,19.1%。分別以L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺為底物采用TLC法測定復性后的酶蛋白活性，催化水解可以得到相應的產(chǎn)物，證明PM1509表達的蛋白有L-谷氨酰胺酶酶活，PM1383

5、和PM3012表達的蛋白有L-天冬酰胺酶活性。⑵利用SOMPA軟件、PredictProtein數(shù)據(jù)庫對PM2486和PM3475基因進行編碼蛋白的二級結構組成預測，結果顯示β-折疊較少，而無規(guī)則卷曲較多且含有半胱氨酸可形成二硫鍵，這些因素導致了復性后的蛋白無活性的可能性較大，故選取巴斯德畢赤酵母GS115進行真核表達。篩選得到的轉化子經(jīng)過驗證大多數(shù)為甲醇利用快型，以甲醇為誘導劑誘導蛋白表達，重組菌甲醇誘導表達后SDS-PAGE檢測目的