人類基因組計(jì)劃及基因測(cè)序

1、人類基因組計(jì)劃與基因測(cè)序,人類基因組計(jì)劃,基因測(cè)序,基因組概述,基因組概述,DNA,基因,基因組,,,DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)——里程碑,1953年，沃森和克里克提出了DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu),標(biāo)志著生物科學(xué)的發(fā)展進(jìn)入了分子生物學(xué)階段，使遺傳的研究深入到分子層次,“生命之謎”被打開,人們清楚地了解遺傳信息的構(gòu)成和傳遞的途徑。,基因——控制生物性狀的基本遺傳單位。,基因（gene）：帶有遺傳訊息的DNA片段稱為基因。,結(jié)構(gòu)基因外顯

2、子 （編碼序列)內(nèi)含子（非編碼序列) 非結(jié)構(gòu)基因順式作用元件啟動(dòng)子上游啟動(dòng)子元件反應(yīng)元件增強(qiáng)子沉默子Poly(A)加尾信號(hào)反式作用因子,基因分類,,,,,基因組——完整的單倍體序列,基因組（Genome）：指單倍體細(xì)胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA分子。人類基因組（人類基因體）：是指人的基因組，由23對(duì)染色體組成，其中包括22對(duì)體染色體、1條X染色體和1條Y染色體。人類只有一個(gè)基因組，大約

3、有2-3萬(wàn)個(gè)基因。人類基因組含有約30億個(gè)DNA堿基對(duì)，,,,人類基因組計(jì)劃,人類基因組計(jì)劃概述目的與意義《人種自傳23章》遺傳圖譜,人類基因組計(jì)劃——概述,人類基因組計(jì)劃(human genome project, HGP)：是由美國(guó)科學(xué)家于1985年率先提出，于1990年正式啟動(dòng)的。美國(guó)、英國(guó)、法國(guó)、德國(guó)、日本和我國(guó)科學(xué)家共同參與了這一預(yù)算達(dá)30億美元的人類基因組計(jì)劃。意義：人類基因組計(jì)劃與曼哈頓原子彈計(jì)劃和阿波羅計(jì)劃并

4、稱為三大科學(xué)計(jì)劃。被譽(yù)為生命科學(xué)的“登月計(jì)劃”。中國(guó)：中國(guó)于1999年9月積極參加到這項(xiàng)研究計(jì)劃中的，承擔(dān)其中1%的任務(wù)，即人類3號(hào)染色體短臂上約3000萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)的測(cè)序任務(wù)。中國(guó)因此成為參加這項(xiàng)研究計(jì)劃的唯一的發(fā)展中國(guó)家。,人類基因組計(jì)劃——概述,目的：揭開組成人體2.5萬(wàn)個(gè)基因的30億個(gè)堿基對(duì)的秘密；方法：要發(fā)現(xiàn)所有的人類基因，找出它們?cè)谌旧w上的位置，破譯人類全部遺傳信息，同時(shí)繪制出人類基因的圖譜。結(jié)果：2001年人類

5、基因組工作草圖的發(fā)表（由公共基金資助的國(guó)際人類基因組計(jì)劃和私人企業(yè)塞雷拉基因組公司各自獨(dú)立完成，并分別公開發(fā)表）被認(rèn)為是人類基因組計(jì)劃成功的里程碑。截止到2005年，人類基因組計(jì)劃的測(cè)序工作已經(jīng)完成。意義：解碼生命、了解生命的起源、了解生命體生長(zhǎng)發(fā)育的規(guī)律、認(rèn)識(shí)種屬之間和個(gè)體之間存在差異的起因、認(rèn)識(shí)疾病產(chǎn)生的機(jī)制以及長(zhǎng)壽與衰老等生命現(xiàn)象、為疾病的診治提供科學(xué)依據(jù)。,1號(hào)染色體——生命。講生命的誕生，來(lái)源。2號(hào)染色體——

6、物種。人類發(fā)展和近親之間的分別。3號(hào)染色體——?dú)v史。孟德爾以及其他科學(xué)家在遺傳學(xué)上做出的貢獻(xiàn)。4號(hào)染色體——命運(yùn)。你的命運(yùn)完全在你的基因里。5號(hào)染色體——環(huán)境。推翻讓讀者覺(jué)得基因是簡(jiǎn)單的分割開來(lái)的。6號(hào)染色體——智慧。基因的存在不是為了致病的7號(hào)染色體——本能。解釋行為遺傳學(xué)和進(jìn)化心理學(xué)結(jié)論對(duì)人類的影響。8號(hào)染色體和9號(hào)染色體——X和Y染色體——沖突。性染色體，同性戀是否遺傳。8號(hào)染色體——自身利益?；蚪M97%都不是真正

7、的基因。基因指紋測(cè)試技術(shù)。9號(hào)染色體——疾病。解釋了血型的不同以及基因?qū)膊〉牡挚沽Α?0號(hào)染色體——壓力。外部事件對(duì)基因的影響。11號(hào)染色體——個(gè)性。性格的天生以及后天對(duì)性格的影響。12號(hào)染色體——自我組裝。基因是編制好的一連串程序，自我運(yùn)行功能。13號(hào)染色體——史前。你知道你為什么能消化牛奶?你祖宗幾千里以前就學(xué)會(huì)了“偷奶”。14號(hào)染色體——永生。壽命長(zhǎng)短實(shí)在不好說(shuō)。萬(wàn)一哪個(gè)基因調(diào)皮一下，你就掛了。15號(hào)染色體——性別

8、。你出生真不是自個(gè)兒決定的事，是男是女，你爸媽也沒(méi)法決定。16號(hào)染色體——記憶。想知道為嘛你記東西老是學(xué)完就忘么。17號(hào)染色體——死亡。癌癥啊!癌癥啊!18號(hào)染色體——?dú)v史?；蚬こ踢@玩意兒。19號(hào)染色體——預(yù)防。你又想知道，你又不想知道。20號(hào)染色體——政治。無(wú)知導(dǎo)致的悲劇。21號(hào)染色體——優(yōu)化人種論。優(yōu)化人種的歷史和現(xiàn)在遺留下來(lái)的歧視。22號(hào)染色體——自由意志。休謨之叉：我們的行為要么是事先已經(jīng)被決定了的，這樣我們就不

9、必為它們負(fù)責(zé);要么是偶然事件的結(jié)果，這樣我們也不必為它們負(fù)責(zé)。,人種自傳23章,人類基因組計(jì)劃——四大遺傳圖譜,轉(zhuǎn)錄圖譜,遺傳圖譜,物理圖譜,序列圖譜,遺傳圖譜：又稱連鎖圖譜（linkage map），它是以具有遺傳多態(tài)性（在一個(gè)遺傳位點(diǎn)上具有一個(gè)以上的等位基因，在群體中的出現(xiàn)頻率皆高于1%）的遺傳標(biāo)記為“路標(biāo)”，以遺傳學(xué)距離（在減數(shù)分裂事件中兩個(gè)位點(diǎn)之間進(jìn)行交換、重組的百分率，1%的重組率稱為1cM）為圖距的基因組圖。,物理圖譜：是

10、利用限制性內(nèi)切酶將染色體切成片段，再根據(jù)重疊序列確定片段間連接順序，以及遺傳標(biāo)志之間物理距離堿基對(duì)(bp) 或千堿基(kb)或兆堿基(Mb)的圖譜。,序列圖譜（sequence map）：序列分析采用一個(gè)區(qū)域的DNA序列重疊群使測(cè)序工作不斷延伸，使用其中的序列標(biāo)記位點(diǎn)STS作為兩個(gè)片段間的重疊區(qū)域，使分別被測(cè)序的短序列進(jìn)行正確的拼接，最后獲得DNA全序列圖譜。,轉(zhuǎn)錄圖譜（transcriptome map）：是在識(shí)別基因組所包含的蛋白質(zhì)

11、編碼序列的基礎(chǔ)上繪制的結(jié)合有關(guān)基因序列、位置及表達(dá)模式等信息的圖譜。在人類基因組中鑒別出占具2%~5%長(zhǎng)度的全部基因的位置、結(jié)構(gòu)與功能，最主要的方法是通過(guò)基因的表達(dá)產(chǎn)物mRNA反追到染色體的位置。,基因測(cè)序——觸手可及,測(cè)序技術(shù),DNA測(cè)序：是對(duì)DNA分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析。意義：分析基因組核苷酸排列序列分析基因序列基因定點(diǎn)誘變的基礎(chǔ)基因工程載體構(gòu)建中DNA序列定位和排序的基礎(chǔ)確定DNA序列中蛋白質(zhì)的編碼區(qū)歷程：第一代測(cè)序

12、技術(shù)：雙脫氧鏈終止法、化學(xué)降解法第二代測(cè)序技術(shù)：焦磷酸測(cè)序、連接酶測(cè)序第三代測(cè)序技術(shù)：?jiǎn)畏肿訜晒鉁y(cè)序第四代測(cè)序技術(shù)：納米孔測(cè)序,測(cè)序技術(shù)——發(fā)展歷程,,,,第一代測(cè)序技術(shù),第一代測(cè)序技術(shù)的主要特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：測(cè)序讀長(zhǎng)可達(dá)1000bp，準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%，從頭測(cè)序，從頭組裝缺點(diǎn)：測(cè)序成本高，通量低，難以大規(guī)模的應(yīng)用,,,,第一代測(cè)序技術(shù)——雙脫氧鏈末端終止法,原理：由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的

13、合成過(guò)程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來(lái)中斷DNA合成反應(yīng)，在4個(gè)DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通過(guò)凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測(cè)分子的DNA序列缺點(diǎn)：1、測(cè)定步驟繁瑣。一個(gè)步驟重復(fù)四次，因此需要大量相同的DNA 拷貝，樣本需求量大；2、不能測(cè)定太長(zhǎng)的DNA 序列。意義：Sanger測(cè)定了第一個(gè)

14、基因組序列，是噬菌體X174的，全長(zhǎng)5375個(gè)堿基。自此，人類獲得了窺探生命遺傳差異本質(zhì)的能力，并以此為開端步入基因組學(xué)時(shí)代。在2001年，完成的首個(gè)人類基因組圖譜就是以改進(jìn)了的Sanger法為其測(cè)序基礎(chǔ)。,,,,第一代測(cè)序技術(shù)——化學(xué)降解測(cè)序法,原理：先對(duì)待測(cè)DNA末端進(jìn)行放射性標(biāo)記，再通過(guò)4-5組相互獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)分別得到部分降解產(chǎn)物，其中每一組反應(yīng)特異性地針對(duì)某一種或某一類堿基進(jìn)行切割。因此，產(chǎn)生4-5 組不同長(zhǎng)度的放射性標(biāo)

15、記的DNA片段，每組中的每個(gè)片段都有放射性標(biāo)記的共同起點(diǎn)，但長(zhǎng)度取決于該組反應(yīng)針對(duì)的堿基在原樣品DNA分子上的位置。此后各組反應(yīng)物通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，通過(guò)放射自顯影檢測(cè)末端標(biāo)記的分子，并直接讀取待測(cè)DNA片段的核苷酸序列。,第二代測(cè)序技術(shù),特點(diǎn)：大大降低了測(cè)序成本的同時(shí)，大幅提高了測(cè)序速度，持了高準(zhǔn)確性，序列讀長(zhǎng)方面起第一代測(cè)序技術(shù)則要短很多。,第二代測(cè)序技術(shù)——Roche 454測(cè)序系統(tǒng),DNA文庫(kù)制備：利用噴

16、霧法將待測(cè)DNA打斷成300-800bp長(zhǎng)的小片段，并在片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎y(cè)DNA變性后用雜交引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫(kù)。,第二代測(cè)序技術(shù)——Roche 454測(cè)序系統(tǒng),Emulsion PCR （乳液PCR，其實(shí)是一個(gè)注水到油的獨(dú)特過(guò)程）：將這些單鏈DNA結(jié)合在水油包被的直徑約28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。乳液PCR最大的特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間以進(jìn)行DNA擴(kuò)增。,第二代測(cè)序

17、技術(shù)——Roche 454測(cè)序系統(tǒng),焦磷酸測(cè)序：測(cè)序反應(yīng)以磁珠上大量擴(kuò)增出的單鏈DNA為模板，每次反應(yīng)加入一種dNTP進(jìn)行合成反應(yīng)。如果dNTP能與待測(cè)序列配對(duì)，則會(huì)在合成后釋放焦磷酸基團(tuán)。釋放的焦磷酸基團(tuán)會(huì)與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化學(xué)酶反應(yīng)生成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測(cè)序反應(yīng)中的熒光素分子并發(fā)出熒光，同時(shí)由PTP板另一側(cè)的CCD照相機(jī)記錄，最后通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行光信號(hào)處理而獲得最終的測(cè)序結(jié)果。,第二代測(cè)序技術(shù)——Ill

18、umina邊合成邊測(cè)序,過(guò)程：DNA待測(cè)文庫(kù)構(gòu)建：超聲波打斷為200-500bp序列片段，并添加接頭；Flowcell，吸附流動(dòng)DNA片段橋式PCR擴(kuò)增與變性：堿基的信號(hào)強(qiáng)度放大測(cè)序：原理同Sanger,第二代測(cè)序技術(shù)——Solid技術(shù),DNA文庫(kù)構(gòu)建：片段打斷并在兩端加上測(cè)序接頭，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫(kù)。Emulsion PCR：小水滴emulsion PCR，微珠只有1um。在擴(kuò)增的同時(shí)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的3’端進(jìn)行修

19、飾，這是為下一步的測(cè)序過(guò)程作的準(zhǔn)備。3’修飾的微珠會(huì)被沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過(guò)程中，沉積小室將每張玻片分成1個(gè)、4個(gè)或8個(gè)測(cè)序區(qū)域。,第二代測(cè)序技術(shù)——Solid技術(shù),連接酶測(cè)序：沒(méi)有采用DNA聚合酶，而采用了連接酶。其底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，將其表示為：3’-XXnnnzzz-5’。探針的5’末端分別標(biāo)記了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料。這個(gè)8堿基單鏈熒光探針中，第1和第2位堿基（

20、XX）上的堿基是確定的，并根據(jù)種類的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的熒光標(biāo)記。這是Solid的獨(dú)特測(cè)序法，兩個(gè)堿基確定一個(gè)熒光信號(hào)，相當(dāng)于一次能決定兩個(gè)堿基。這種測(cè)序方法也稱之為兩堿基測(cè)序法。,第三代測(cè)序技術(shù)——單分子測(cè)序技術(shù),案例：PacificBiosciences公司 RS系統(tǒng)特點(diǎn)： 不需要PCR擴(kuò)展，消除了潛在的擴(kuò)展錯(cuò)誤和不均勻?？梢灾苯娱喿xRNA的序列。例如：Helicos直接使用RNA反轉(zhuǎn)錄酶，邊RNA

21、反轉(zhuǎn)錄合成邊測(cè)序。 可以直接閱讀包括甲基化在內(nèi)的DNA修飾。例如：Pacbio使用甲基化和非甲基化堿基的合成速率上的差異來(lái)進(jìn)行區(qū)分。 讀長(zhǎng)更長(zhǎng)。PacBio系統(tǒng)可以測(cè)到1000bp以上。速度更快。,第三代測(cè)序技術(shù)——PacBio SMRT技術(shù),原理：對(duì)零模波導(dǎo)中的單個(gè)熒光分子進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)，從而快速獲得DNA序列信息。DNA聚合酶和模板結(jié)合,4色熒光標(biāo)記 4 種堿基（即是dNTP）,在堿基配對(duì)階段,不同堿

22、基的加入,會(huì)發(fā)出不同光,根據(jù)光的波長(zhǎng)與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類型。同時(shí)這個(gè) DNA 聚合酶是實(shí)現(xiàn)超長(zhǎng)讀長(zhǎng)的關(guān)鍵之一,讀長(zhǎng)主要跟酶的活性保持有關(guān),它主要受激光對(duì)其造成的損傷所影響。,第四代測(cè)序技術(shù)——納米孔測(cè)序技術(shù),原理：分子在通過(guò)納米孔道時(shí)，會(huì)對(duì)通過(guò)納米孔的電流，或橫穿過(guò)納米孔的電流（隧穿電流）產(chǎn)生影響，而每種不同的分子通過(guò)時(shí)，對(duì)電流產(chǎn)生的影響具有可區(qū)別的差異。于是利用這種差異，納米孔測(cè)序技術(shù)就可以識(shí)別基因中堿基（對(duì)）的排列順序。,第四代

23、測(cè)序技術(shù)——納米孔測(cè)序技術(shù),特點(diǎn)：物理方法，無(wú)需生物化學(xué)預(yù)處理，直接對(duì)DNA進(jìn)行讀取；真正實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)和電子傳導(dǎo)檢測(cè)相結(jié)合的測(cè)序方法；完全擺脫了洗脫過(guò)程、PCR擴(kuò)增過(guò)程；成本低廉：最有希望實(shí)現(xiàn)1000美元基因組甚至100美元基因組的技術(shù)，超高讀長(zhǎng)；高通量；易集成，小型化；速度快，測(cè)序時(shí)間更少；數(shù)據(jù)分析更為簡(jiǎn)單；實(shí)現(xiàn)了從低讀長(zhǎng)到超高讀長(zhǎng)、從光學(xué)檢測(cè)到電子傳導(dǎo)檢測(cè)的雙重跨越。,其他測(cè)序技術(shù)——Ion Torrent,原

24、理：布滿小孔的高密度半導(dǎo)體芯片， 一個(gè)小孔就是一個(gè)測(cè)序反應(yīng)池。當(dāng)DNA聚合酶把核苷酸聚合到DNA鏈上時(shí)，會(huì)釋放出一個(gè)氫離子，反應(yīng)池中PH發(fā)生改變，位于池下離子感受器感受到H+信號(hào)，H+信號(hào)再轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)。,其他測(cè)序技術(shù)——Ion Torrent,文庫(kù)和樣本制備跟454技術(shù)很像，只是測(cè)序過(guò)程中通過(guò)檢測(cè)H+信號(hào)的變化來(lái)獲得序列堿基信息。,其他測(cè)序技術(shù)——Ion Torrent,特點(diǎn)：Ion Torrent相比于其他測(cè)序技術(shù)來(lái)說(shuō)，不需要昂貴