雙T-DNA共轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因番木瓜的研究.pdf

1、番木瓜采后貯藏期間和鮮切加工后的迅速軟化所導(dǎo)致果實的腐敗變質(zhì)，已成為制約其商品化生產(chǎn)的重要因素。在前人對番木瓜進行采后生理研究與反義ACS和ACO基因遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上，本文從中鎖定了與番木瓜果實后熟軟化密切相關(guān)的關(guān)鍵細胞壁水解酶β-GAL，從分子水平再次探討了其與番木瓜果實軟化的關(guān)系。通過構(gòu)建含果實特異性啟動子的RNAi雙T-DNA植物表達載體，經(jīng)由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番木瓜胚性愈傷組織，獲得了共轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因再生植株，為進一步選育生理上可以正常

2、成熟、且適于鮮切加工的無選擇標記基因抗軟化轉(zhuǎn)基因番木瓜奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下： 1.建立了適于番木瓜遺傳轉(zhuǎn)化的體胚發(fā)生系統(tǒng)。以‘漳紅’番木瓜組培苗的葉片和葉柄為外植體，在改良MS+0.5 mg·L-1 KT+1.0 mg·L-12，4-D+0.5mg·L-1 BA+0.1 mg·L-1 NAA+400 mg·L-1 Glu+30 g·L-1蔗糖的固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出了胚性愈傷組織。其中，CⅡa型胚性愈傷在一定條件下能夠繼代增殖，并

3、能向CⅡb型轉(zhuǎn)變，CⅡb型胚性愈傷則容易發(fā)生體胚。采用兩步生根法，將胚性愈傷所形成的體胚再生植株先接種于1/2 MS+0.5 mg·L-1 IBA+1.0 g·L-1 AC+30g·L-1蔗糖的固體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)7天后，轉(zhuǎn)移至1/2 MS+1.0 g·L-1 AC+25μM·L-1VB12+30 g·L-1蔗糖的固體培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，生根效果最好。移栽成活率可達45％以上。 2.克隆并分析了番木瓜果肉中第一類β-Gal基因。通過

4、一對簡并引物，研究番木瓜果實后熟軟化過程中β-Gal基因家族表達水平的總體變化趨勢，從分子水平證實了β-GALs與番木瓜果實軟化的相關(guān)性，并從50％成熟度果實中克隆了果肉加速軟化時表達豐度最高的第一類β-Gal基因。分離了該類β-Gal基因4501 bp的基因組序列，經(jīng)比對，其共含有17個內(nèi)含子，外顯子部分核苷酸序列與GenBank中的cDNA只有1個堿基的差異。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該番木瓜β-GAL屬于糖苷水解酶超級家族42中家族

5、35的成員，在進化過程中與擬南芥具有較近的親緣關(guān)系，與鱷梨和北美云杉則關(guān)系較遠。同時，它還具有一段定位于胞外的信號肽，推測它可能參與細胞壁的降解。 3.分離了番木瓜第一類β-Gal基因啟動子，并進行了初步的功能鑒定。利用反向PCR技術(shù)，分離了第一類β-Gal基因1143 bp的5’端調(diào)控序列。在線預(yù)測結(jié)果表明，該片段含有核心啟動子元件TATA盒，轉(zhuǎn)錄起始位點在起始密碼子上游-133處。同時，還發(fā)現(xiàn)了與如乙烯等植物激素和脅迫應(yīng)答元

6、件，根部和胚胎器官特異性元件，以及增強子區(qū)域。利用該片段取代pCAMBIA1301載體上GUS基因前的CaMV35S啟動子，經(jīng)由農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)侵染番木瓜不同組織器官，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的啟動子功能，為傷誘導(dǎo)類型，并與特定器官的發(fā)育相關(guān)。GUS活性在果肉中最強，其次為胚和根部，其它器官中則不表達。 4.構(gòu)建了用于番木瓜遺傳轉(zhuǎn)化的植物表達載體。將β-Gal基因保守區(qū)反向重復(fù)插入載體pKANNIBAL構(gòu)建RNAi中間表達載體pKA

7、N/RG。將其上發(fā)夾結(jié)構(gòu)取代經(jīng)改造的載體pCAMBIA1300上hptⅡ基因，構(gòu)建中間表達載體p1300-/MFRG。分離其上單T-DNA區(qū)段，與載體pCAMBIA2301構(gòu)建RNAi雙T-DNA植物表達載體p2301/TTRG。將兩端含有BamHⅠ和SalⅠ粘性末端的β-Gal基因啟動子片段、p2301/TTRG經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切后的大片段和p2301/TTRG經(jīng)XbaⅠ和SalⅠ雙酶切后的小片段相連接，構(gòu)建含有果實特異性啟

8、動子的RNAi雙T-DNA植物表達載體。酶切分析和PCR檢測表明，p2301/TTRG和p2301/ BPTTRG均被成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，可用于后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究。 5.開展了以攜帶植物表達載體p2301/TTRG的農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的番木瓜遺傳轉(zhuǎn)化方法和體系優(yōu)化的研究。探索了液體振蕩轉(zhuǎn)化法、浸泡轉(zhuǎn)化法、體胚針刺法和莖段轉(zhuǎn)化對番木瓜轉(zhuǎn)化效率和共轉(zhuǎn)化效率的影響，以前兩種方法的效果較好，以浸泡轉(zhuǎn)化法的“100μmol·L

9、-1 AS+菌液OD為0.2+侵染20 min+共培養(yǎng)2 d”為本試驗的最佳轉(zhuǎn)化組合；“100μmol·L-1 AS+菌液OD為0.2+侵染20 min+共培養(yǎng)3d”為最佳的共轉(zhuǎn)化組合。后兩種方法則不太適于番木瓜的遺傳轉(zhuǎn)化。最終，獲得了5株轉(zhuǎn)基因再生植株，經(jīng)PCR和Southern雜交檢測結(jié)果表明，只有2株為共轉(zhuǎn)化的結(jié)果，誘導(dǎo)了其中1株生根并移栽。 6.開展了番木瓜轉(zhuǎn)BPTTRG基因和轉(zhuǎn)MFRG的初步研究。利用浸泡轉(zhuǎn)化法，以攜帶

10、植物表達載體p2301/BPTTRG和p1300-/MFRG的農(nóng)桿菌EHA105，分別侵染CⅡb型胚性愈傷組織。前者獲得了經(jīng)GUS染色、PCR檢測和Southern雜交結(jié)果為陽性的共轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因番木瓜再生植株。后者從198株再生植株的62個DNA混合池中，PCR檢測出了兩個陽性池。進一步對混合池中的單株分別進行PCR檢測，則未能成功分離出轉(zhuǎn)基因植株，在不含抗生素選擇壓的條件下的遺傳轉(zhuǎn)化可能出現(xiàn)了嵌合體現(xiàn)象。 以上研究獲得的雙T-D