基于鋅指文庫的Ni2+等金屬離子組合肽篩選與微生物作用研究.pdf

1、社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，一方面極大地提高了人們的物質生活水平，同時也給我們的生存環(huán)境帶來了重大的壓力與挑戰(zhàn)，因重金屬污染帶來的環(huán)境事故與危害，也已引起社會的高度關注和重視。微生物修復技術，作為環(huán)境重金屬治理的一種重要途徑，近年來得到廣泛地研究與進展，而基因工程改造的微生物(GMO)是微生物修復技術的主要發(fā)展方向。其中的難點和要點是獲得高親和力的重金屬結合肽（結合分子）以及篩選和獲得高富集及耐受能力的環(huán)境微生物。鋅指蛋白作為生物體內存在的重要

2、轉錄因子，一方面參與了胞內DNA轉錄相關的多種生理生化過程，同時也為Zn2+、Ni2+等重金屬結合肽的獲得提供了重要的生物來源。而重金屬礦區(qū)同時也為重金屬富集及耐受微生物菌株的獲得提供了天然了菌種資源庫。
　　 本研究是基于實驗室在前期工作中已經(jīng)構建好的C2H2型鋅指蛋白為基本骨架構建的細菌限制性肽庫，利用Percoll密度梯度離心分離和篩選Zn2+、Ni2+重金屬結合肽并測定其序列，然后利用生物信息學軟件對測得的序列進行多重序

3、列比對，進一步確定Zn2+、Ni2+的高親和力結合肽的序列特征;再通過親和力反篩測定以及重金屬吸附含量測定等方法進一步確認篩選得到的重金屬結合多肽對Zn2+、Ni2+的高效或專一性結合特性。然后在以上工作的基礎上，再分別對Zn2+和Ni2+的金屬結合肽序列進行氨基酸成分分析，以找到這些金屬結合肽所共有的性質和規(guī)律。同時我們從鎳礦尾礦中分離篩選得到Ni高耐受菌株，并利用相關的分子生物學技術—16SrDNA鑒定方法結合其生理生化特性對得到的

4、菌株進行菌種鑒定。C2H2型鋅指蛋白細菌限制型隨機肽庫的篩選的目的是期望能從中獲得Ni等高親和力結合肽，而從礦區(qū)土壤中篩選耐Ni微生物是為進一步工程菌的改造和重金屬修復提供基礎。
　　 主要研究結果:
　　 1.從實驗室前期工作中已構建好的C2H2型鋅指蛋白細菌限制性肽庫中篩選得到了19條Zn2+和Ni2+結合肽。
　　 2.經(jīng)4輪篩選得到的Zn2+結合肽以及Ni2+結合肽與金屬離子的結合能力隨篩選輪數(shù)遞增而增加

5、，P/N值分別可高達94.6和141.0。通過PAGE電泳測得融合蛋白的大小約為75KD。對P/N值較大的(P/N＞10)展示菌進行重金屬吸附測定，發(fā)現(xiàn)展示菌6#和16#對重金屬Ni的吸附能力較好，吸附率均可以達到50％左右，展示菌5#，17#對重金屬的吸附效果未能達到理想的效果。
　　 3.經(jīng)過對Zn2+和Ni2+結合肽序列進行生物信息學分析后發(fā)現(xiàn)具有以下共有序列特征:-H-X4-H-、-F-X-F-。其中氨基酸Ala、Thr