蘿卜肉質(zhì)直根膨大相關(guān)基因與microRNAs鑒定.pdf

1、蘿卜(Raphanus sativus L.)，十字花科蘿卜屬一、二年生草本植物，是原產(chǎn)于我國(guó)的重要根菜類蔬菜作物。蘿卜以膨大的肉質(zhì)直根為主要產(chǎn)品器官，不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且富含糖、維生素和蘿卜硫素等，具有較高的藥用食療價(jià)值。肉質(zhì)直根發(fā)育的大小直接影響蘿卜產(chǎn)量與品質(zhì)。因此，研究蘿卜肉質(zhì)直根膨大的分子機(jī)理與遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要意義。蘿卜肉質(zhì)直根膨大是一個(gè)復(fù)雜的生物過程，包括形態(tài)發(fā)生和干物質(zhì)積累等，前人研究主要集中在其結(jié)構(gòu)形態(tài)與生理生化機(jī)制方面

2、，但關(guān)于蘿卜肉質(zhì)直根膨大關(guān)鍵基因分離鑒定研究報(bào)道甚少，導(dǎo)致蘿卜肉質(zhì)根形成分子調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。鑒于此，本研究以蘿卜高代自交系‘NAU-YH’為試材，采用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)對(duì)蘿卜肉質(zhì)直根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組de novo測(cè)序，并以轉(zhuǎn)錄組序列為參考基因，分析肉質(zhì)直根膨大的數(shù)字基因表達(dá)譜和miRNA表達(dá)譜，分離鑒定蘿卜肉質(zhì)直根膨大相關(guān)基因與miRNA，以期為深入解析蘿卜肉質(zhì)直根膨大分子機(jī)制提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:

3、　　1.為系統(tǒng)獲得蘿卜肉質(zhì)根轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究以蘿卜不同發(fā)育時(shí)期（包括破肚前期、破肚期和膨大期）的肉質(zhì)直根等量混樣構(gòu)建了1個(gè)cDNA文庫(kù)，采用Illumina HiSeq2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。共獲得51.17M clean reads數(shù)據(jù)，通過拼接得到70，168條unigenes，總長(zhǎng)度為50.28 Mb，平均長(zhǎng)度為717 nt，N50為636 nt。其中，63，991條unigenes(占總數(shù)91.20％)可比對(duì)到NCBI

4、 non-redundant(NR)、Gene Ontology(GO)、Clusters of Orthologous Group(COG)、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)和核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(Nt)等公共數(shù)據(jù)庫(kù)。GO分析表明所得unigenes主要參與生理代謝、催化反應(yīng)、結(jié)合過程和細(xì)胞過程等。另外，基于KEGG pathway分析，分離鑒定出8個(gè)參與蔗糖代謝的酶家族(103個(gè)uni

5、genes)。其中，通過基因克隆分析驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拼接所得2個(gè)蘿卜蔗糖代謝基因RsSuSy1和RsSPS1基因序列，并通過RT-qPCR分析了6個(gè)蔗糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示所有基因在蘿卜不同發(fā)育時(shí)期不同部位均有表達(dá)，且表達(dá)量呈動(dòng)態(tài)變化。此外，基于轉(zhuǎn)錄組序列與同源克隆技術(shù)，克隆得到了蘿卜肉質(zhì)根形成相關(guān)RsCLE41和RsSA UR基因的基因組DNA及cDNA序列。其中，RsCLE41基因開放閱讀框(ORF)為300 bp，推導(dǎo)

6、編碼99個(gè)氨基酸;RsSAUR開放閱讀框長(zhǎng)327 bp，編碼108個(gè)氨基酸。利用RT-qPCR技術(shù)分析了蘿卜肉質(zhì)直根膨大過程中RsCLE41和RsSAUR基因的表達(dá)特征。結(jié)果表明，RsCLE41基因在蘿卜根和莖中表達(dá)量相對(duì)較高，且在肉質(zhì)直根破肚前期表達(dá)量最高。RsSAUR基因在破肚期表達(dá)量最高，破肚前期莖中表達(dá)量最高，其它時(shí)期根中表達(dá)量相對(duì)較高。本研究結(jié)果將為蘿卜肉質(zhì)直根膨大形成的分子機(jī)理和肉質(zhì)直根膨大過程中關(guān)鍵基因分離鑒定提供了重要信

7、息基礎(chǔ)。
　　2.為鑒定蘿卜肉質(zhì)直根膨大過程中的miRNA及其靶基因，本研究以蘿卜肉質(zhì)直根為試材，構(gòu)建了破肚前期(10 DAS)、破肚期(20 DAS)、膨大期(40 DAS)三個(gè)小RNA文庫(kù)，利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)鑒定到175個(gè)已知與107個(gè)新型miRNA;其中85個(gè)已知和13個(gè)新型miRNA在蘿卜肉質(zhì)根膨大過程中呈現(xiàn)顯著性差異表達(dá)。此外，預(yù)測(cè)到差異表達(dá)miRNA的191個(gè)靶基因，包含轉(zhuǎn)錄因子和其他功能蛋白，可參與生長(zhǎng)發(fā)

8、育、細(xì)胞過程，信號(hào)感應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)以及植物防衛(wèi)反應(yīng)等生物過程，并具有較好的結(jié)合能力和催化活性等分子功能。進(jìn)一步分析表明，部分靶向基因（如NF-YA2、ILR1、bHLH74、XTH16、CEL41和EXPA9等）在蘿卜肉質(zhì)直根膨大過程中發(fā)揮重要作用。利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)5個(gè)miRNA及其靶基因進(jìn)行表達(dá)模式驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)4個(gè)miRNA表達(dá)模式與測(cè)序結(jié)果基本一致。研究結(jié)果為解析miRNA在蘿卜肉質(zhì)直根膨大過程中的分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

9、　　3.為系統(tǒng)分離蘿卜肉質(zhì)直根膨大關(guān)鍵基因，本研究構(gòu)建了蘿卜肉質(zhì)直根破肚前期，(L1)、破肚期(L2)、膨大期(L3)三個(gè)cDNA文庫(kù)，利用Illimina/HiSeq2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜分析(DGE)。結(jié)果表明，在L1、L2和L3文庫(kù)中分別獲得7，219，043，7，047，977和7，161，612條clean reads，分別包含72，874，68，723和67,767個(gè)轉(zhuǎn)錄本。其中差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本分別為10，450個(gè)

10、(L1 vs.L2)、12，325個(gè)(L1 vs.L3)與7，392個(gè)(L2 vs.L3)。GO富集分析表明差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本主要參與細(xì)胞代謝、單一生物過程以及脅迫響應(yīng)等過程，并具有較好的結(jié)合能力和催化活性等功能;Pathway功能富集分析鑒定出127(L1 vs.L2)、126(L1 vs.L3)和122(L2 vs.L3)條代謝途徑，其中植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(ko04075)和淀粉與蔗糖代謝(ko00500)包含差異轉(zhuǎn)錄本數(shù)量最多。此外，通