玉米轉基因新方法的研究.pdf

1、轉基因玉米是目前種植面積最廣的轉基因農作物。國內外許多機構都致力于玉米轉基因的研究，目前，玉米轉基因方法主要采用農桿菌介導法和基因槍法，但是這兩種方法都需要經(jīng)過組織培養(yǎng)，不僅花費高耗時長，轉基因效率不高，且受受體基因型限制。近年來，國內學者還嘗試了電泳法、胚芽鞘針刺法、超聲波法等DNA直接導入方法，有的方法還申請了國家發(fā)明專利。但是這些方法的轉基因機理尚不明確，也沒有得到廣泛應用。本文以蘇玉19為材料，開展了以花粉為受體的玉米轉基因新方

2、法研究，探索了采用農桿菌浸染玉米離體花粉培養(yǎng)法和超聲波處理法將外源基因導入玉米花粉，通過授粉直接獲得轉基因玉米種子的技術體系。通過對花粉培養(yǎng)基、花粉培養(yǎng)溫度、萌發(fā)時間、農桿菌浸染時間以及超聲波處理的強度、時間、去污劑等技術因子進行了探索和優(yōu)化，初步建立了農桿菌介導的外源基因導入離體萌發(fā)花粉的玉米轉基因新方法。主要結果如下:
　　1.建立了一套完善的玉米花粉采集、保存、培養(yǎng)技術體系，使得離體玉米花粉萌發(fā)率達到60％以上。通過對玉米花

3、粉采集和保存方法的比較，發(fā)現(xiàn)在大田里取玉米雄蕊而獲得的花粉比在大田中直接采集的花粉萌發(fā)率高;將花粉于低溫下貯藏比室溫下貯藏的活力高。因此，我們選擇在上午9-10點，由玉米雄蕊旗葉下20cm左右剪斷，放在冰盒中帶回實驗室，取1小時內散出的花粉進行實驗。比較不同培養(yǎng)基對玉米花粉萌發(fā)的影響，結果表明，300 mg/L Ca(NO3)2·4H2O，100 mg/L H3BO3，200 mg/LMgSO4·7H2O，100 mg/L KNO3為最

4、佳基本培養(yǎng)基;對蔗糖濃度從10％到40％進行探索，發(fā)現(xiàn)花粉在不同的蔗糖培養(yǎng)基中均可以萌發(fā)，但在15％的蔗糖溶液中萌發(fā)率相對較高;在花粉培養(yǎng)基中加入15％PEG4K，發(fā)現(xiàn)花粉在加入15％ PEG4K的培養(yǎng)基中萌發(fā)率明顯提高;通過對培養(yǎng)溫度的探索，發(fā)現(xiàn)花粉在27℃時萌發(fā)率大于30℃;對花粉體外萌發(fā)的時間進行探索，發(fā)現(xiàn)花粉在培養(yǎng)0.5h萌發(fā)率最高。因此，玉米花粉應在最佳培養(yǎng)基中添加15％蔗糖，以及15％ PEG4K，27℃培養(yǎng)0.5h。

5、>　　2.農桿菌介導法將外源基因導入玉米體外萌發(fā)花粉的研究:以綠色熒光蛋白(GFP)為報告基因，研究了三種不同農桿菌菌株(EHA105、GV3103、LBA4404)、兩種不同去污劑(Silwet-L77、Tween20)、三種農桿菌濃度（OD600為0.4、0.6、0.8）以及五個不同的農桿菌與花粉共培養(yǎng)時間對離體培養(yǎng)花粉轉化效率的影響。結果發(fā)現(xiàn):在培養(yǎng)基中添加Silwet-L77，農桿菌浸染10min時，轉化效率達到最高。三種菌株介

6、導的轉化率沒有太大的差異。以Bar基因為報告基因，將農桿菌轉化的花粉進行授粉，獲得T0代種子。對T0代玉米幼苗分別進行了草丁膦抗性鑒定和Bar基因PCR檢測，陽性轉化率從0-7.27％都有分布，平均達到2.22％。Southern雜交檢測結果顯示，轉化植株的基因組DNA中有Bar基因插入。
　　3.超聲波介導DNA直接轉化離體花粉的研究:通過對超聲波處理強度、時間、次數(shù)等因素進行試驗，試圖建立一套優(yōu)化的方法體系。以Bar基因為報告