FTY720對(duì)CD4+記憶T細(xì)胞介導(dǎo)的移植物排斥反應(yīng)的抑制作用的研究.pdf

1、第一部分建立小鼠腹部異位心臟移植模型目的:探討建立小鼠腹部異位心臟移植模型的手術(shù)方法及技術(shù)改進(jìn)。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)分為2組：同系移植組，供、受體均為C57BL/6小鼠；同種異基因移植組，供體為C3H小鼠，受體為C57BL/6小鼠；每組各50對(duì)小鼠。采用供心主動(dòng)脈與受體腹主動(dòng)脈、供心肺動(dòng)脈與受體下腔靜脈端側(cè)吻合的方法，對(duì)小鼠進(jìn)行腹部心臟移植術(shù)，術(shù)后記錄兩組小鼠供心的存活時(shí)間，觀察供心的組織學(xué)改變。結(jié)果:2組小鼠行腹部心臟移植手術(shù)共

2、100對(duì)，存活91對(duì)，建模成功率為91％。同種異基因移植組供心平均存活時(shí)間為（7.7±0.8）d；而在同系移植組中，除2只小鼠在術(shù)后第7天因出現(xiàn)暖風(fēng)機(jī)意外死亡之外，其余受體小鼠的供心在移植后第40天（觀察終點(diǎn)）均存活，兩組之間有顯著性差異（P<0.01）。結(jié)論:利用小鼠腹部異位心臟移植的手術(shù)方法可建立穩(wěn)定可靠的心臟移植模型，適用于移植免疫學(xué)方面的研究。
　　
　　 第二部分同種反應(yīng)性CD4+記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生、純化、表型

3、及功能的檢測(cè)目的:研究同種反應(yīng)性CD4+記憶T細(xì)胞（Tm）的免疫磁珠分離方法，以及檢測(cè)其表型及功能。方法:利用小鼠皮膚移植模型，通過免疫磁珠技術(shù)分離同種反應(yīng)性CD4+Tm，應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)染色法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活性、純度和鑒定表型，并在體外借助ELISPOT檢測(cè)CD4+Tm在不同抗原刺激時(shí)IFN-γ的分泌頻數(shù)。結(jié)果:上述方法分離所得的活細(xì)胞百分率為（98.9±0.3）％，其中CD4+CD44+CD62L-CCR7-細(xì)胞的比例約為95％，

4、符合CD4+Tm的表型特征，且經(jīng)檢測(cè)其IFN-γ的分泌具有良好的供體特異性。結(jié)論:通過小鼠皮膚移植模型和免疫磁珠分離技術(shù)，制備高純度的CD4+Tm，同時(shí)使其細(xì)胞活力不受影響，并具有良好的供體特異性，可作為穩(wěn)定可靠的分離Tm的方法，為深入研究其在移植免疫方面的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三部分小劑量FTY720對(duì)CD4+記憶T細(xì)胞介導(dǎo)的心臟移植物排斥反應(yīng)的影響及其機(jī)制研究目的:探討小劑量FTY720對(duì)CD4+記憶T細(xì)胞介導(dǎo)的小鼠心臟

5、移植物排斥反應(yīng)的影響，并探討其機(jī)制。方法：通過皮膚移植模型和免疫磁珠技術(shù)分離同種反應(yīng)性CD4+記憶T細(xì)胞（Tm），經(jīng)尾靜脈過繼性輸入，借助小鼠腹部異位心臟移植模型，研究小劑量FTY720對(duì)CD4+Tm介導(dǎo)的同種異體移植物的存活時(shí)間、移植物組織病理學(xué)、Th細(xì)胞因子分泌等的影響。用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)移植心臟中CD4+T淋巴細(xì)胞的浸潤情況，以及顆粒酶B和FasL的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)分為4組：A.同種異基因移植組，即陽性對(duì)照組；B. 陰性對(duì)照組，利用

6、RAG1-/-小鼠（體內(nèi)無成熟的T、B淋巴細(xì)胞）作為移植受體；C. Tm組，RAG1-/-小鼠在移植前1天經(jīng)尾靜脈過繼性輸入CD4+Tm；D.FTY720處理組，RAG1-/-小鼠在移植前4天開始FTY720灌胃0.3mg/kg/d，術(shù)前1天經(jīng)尾靜脈過繼性輸入CD4+Tm。結(jié)果：在同種異基因抗原的刺激下，CFSE標(biāo)記的CD4+Tm在體內(nèi)出現(xiàn)明顯的增殖。與未輸注Tm的陰性對(duì)照組相比，Tm組移植物的平均存活時(shí)間明顯縮短；心肌的中環(huán)層有較多C

7、D4+T淋巴細(xì)胞浸潤；僅冠脈周圍有少量顆粒酶B表達(dá)；但有大量的FasL陽性細(xì)胞浸潤，主要分布于心外膜及心內(nèi)膜下，尤以血管周圍較為明顯。各組之間的差異有顯著性（P<0.01）。FTY720組供心的存活時(shí)間比Tm組延長，移植物內(nèi)未見明顯CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤，以及顆粒酶B和FasL的表達(dá)，同時(shí)顯著抑制了IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10細(xì)胞因子的分泌（P<0.01）。結(jié)論：同種反應(yīng)性CD4+Tm能直接浸潤至移植物，縮短其存活時(shí)間，在