重組人乳鐵蛋白對(duì)一代延長(zhǎng)試驗(yàn)大鼠免疫功能及神經(jīng)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　研究轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白牛乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)的重組人乳鐵蛋白（Recombinant human lactoferrin,rhLF）對(duì)子代大鼠免疫功能及神經(jīng)行為的影響。本研究開(kāi)展了重組人乳鐵蛋白的一代延長(zhǎng)試驗(yàn)，目的是豐富重組人乳鐵蛋白的安全性評(píng)價(jià)資料，為風(fēng)險(xiǎn)管理和風(fēng)險(xiǎn)交流提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.重組人乳鐵蛋白氨基酸組成檢測(cè)及重組人乳鐵蛋白飼料成分分析
　　運(yùn)用國(guó)標(biāo)方法對(duì)重組人乳鐵蛋白進(jìn)行氨基酸分析

2、。重組人乳鐵蛋白全替換標(biāo)準(zhǔn)AIN-93G飼料中蛋白質(zhì)作為重組人乳鐵蛋白組飼料，標(biāo)準(zhǔn)AIN-93G飼料作為對(duì)照組飼料。飼料由北京華阜康飼料公司制作。由北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所對(duì)重組人乳鐵蛋白組飼料及對(duì)照組飼料進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)。
　　2.重組人乳鐵蛋白對(duì)子代大鼠免疫功能的影響
　　參照一代繁殖毒性擴(kuò)展試驗(yàn)指南（OECD443）進(jìn)行免疫功能試驗(yàn)，重點(diǎn)研究親代大鼠在孕期和哺乳期暴露rhLF對(duì)子代大鼠免疫功能的影響，以及子代大鼠在斷乳后持續(xù)

3、暴露rhLF對(duì)其免疫功能的影響。選擇PND0、PND21及PND56的子代大鼠進(jìn)行相應(yīng)的進(jìn)行免疫功能評(píng)價(jià)。
　　SPF級(jí)11周齡Wistar大鼠，雌鼠60只，雄鼠30只，適應(yīng)環(huán)境一周后，隨機(jī)分為對(duì)照組（酪蛋白）、重組人乳鐵蛋白組，按照蛋白20％的比例摻入飼料進(jìn)行全食物喂養(yǎng)。雌雄大鼠喂養(yǎng)相應(yīng)飼料兩周后進(jìn)行交配，各組雌鼠在交配期、妊娠期和哺乳期繼續(xù)給予相應(yīng)飼料，子代大鼠從斷乳到處死繼續(xù)給予相應(yīng)飼料。子代大鼠PND0（出生后第0天）每窩

4、隨機(jī)選一只子代大鼠進(jìn)行脾臟和胸腺淋巴細(xì)胞分型，保證每組20窩PND0子代大鼠要有雌鼠10只、雄鼠10只。子代大鼠PND4（出生后第4天），進(jìn)行窩標(biāo)準(zhǔn)化，隨機(jī)剔除多余子代大鼠，調(diào)整為8只/窩，雌雄各半[4]，在PND0、7、14和21稱重。于PND21子代大鼠斷乳時(shí)，進(jìn)行淋巴細(xì)胞分型（T/B/NK，CD3/CD4/CD8），每組20窩保證PND21檢測(cè)的子代大鼠中有雌鼠10只，雄鼠10只。子代大鼠于PND56(出生后第56天)進(jìn)行淋巴細(xì)胞

5、分型和免疫功能評(píng)價(jià)試驗(yàn)。
　　本研究參考人用藥物免疫毒性試驗(yàn)指導(dǎo)原則（ICH S8），選取了血常規(guī)；血生化；外周血、脾、胸腺及潘氏結(jié)淋巴細(xì)胞表型分析（CD3/CD4/CD8、T/B/NK）；溶血空斑試驗(yàn)（PFC）；淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)；NK細(xì)胞活性試驗(yàn)等。指標(biāo)涵蓋了體液免疫、細(xì)胞免疫和非特異性免疫。
　　3.重組人乳鐵蛋白對(duì)子代大鼠神經(jīng)行為的影響
　　3.1.子代大鼠早期生理發(fā)育組合測(cè)試
　　子代大鼠出生后以窩為單位

6、，在出生后特定的天數(shù)檢查子代大鼠成活率、性別比、出牙時(shí)間、耳廓分離時(shí)間、開(kāi)眼時(shí)間和出毛時(shí)間等生理發(fā)育指標(biāo)。
　　3.2.子代大鼠早期神經(jīng)發(fā)育組合測(cè)試
　　子代大鼠出生后以窩為單位，在出生后特定的天數(shù)檢查子代大鼠平面翻正、懸崖回避、空中翻正、前肢懸掛、聽(tīng)覺(jué)驚嚇等神經(jīng)行為指標(biāo)。各發(fā)育指標(biāo)達(dá)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)為：同窩所有子代大鼠該項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)標(biāo)的天數(shù)。每組觀察20窩。
　　3.3.子代大鼠感覺(jué)運(yùn)動(dòng)測(cè)試
　　PND28重組人乳鐵蛋白組

7、和對(duì)照組每窩隨機(jī)挑選1只雄鼠或雌鼠（每組10只雄性和10只雌性）進(jìn)行熱板測(cè)試、轉(zhuǎn)棒測(cè)試和抓力測(cè)試。
　　3.4.子代大鼠學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)測(cè)試
　　在PND70分別從各組（重組人乳鐵蛋白組和對(duì)照組）隨機(jī)選取的雌雄大鼠各10只（每窩隨機(jī)挑選1只雄鼠或雌鼠）進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)，對(duì)子代大鼠學(xué)習(xí)記憶行為進(jìn)行評(píng)價(jià)，觀察rhLF對(duì)子代大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.重組人乳鐵蛋白氨基酸含量和組成檢測(cè)及重組人

8、乳鐵蛋白飼料成分分析
　　對(duì)重組人乳鐵蛋白與酪蛋白（casein，CAS）的17種氨基酸進(jìn)行定量測(cè)定。飼料營(yíng)養(yǎng)成分分析檢測(cè)結(jié)果表明，重組鐵蛋白飼料和酪蛋白飼料的主要營(yíng)養(yǎng)成分含量接近。
　　2.重組人乳鐵蛋白對(duì)子代大鼠免疫功能的影響
　　與對(duì)照組比較，重組人乳鐵蛋白組子代大鼠血常規(guī)、血生化和淋巴細(xì)胞分型結(jié)果未見(jiàn)明顯改變；溶血空斑試驗(yàn)（PFC）、淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)及NK細(xì)胞活性試驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

9、　　3.重組人乳鐵蛋白對(duì)子代大鼠神經(jīng)行為的影響
　　3.1.子代大鼠早期生理和神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)
　　子代大鼠出生后子代大鼠以窩為單位，檢查了子代大鼠早期生理發(fā)育指標(biāo)（成活率、性別比、出牙時(shí)間、耳廓分離時(shí)間、開(kāi)眼時(shí)間和出毛時(shí)間）和早期神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)(平面翻正、懸崖回避、空中翻正、前肢懸掛)，檢查結(jié)果顯示，測(cè)試結(jié)果顯示rhLF組和對(duì)照組之間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3.2.子代大鼠感覺(jué)運(yùn)動(dòng)測(cè)試
　　選

10、擇傷害性知覺(jué)測(cè)試（熱板試驗(yàn)）、平衡能力測(cè)試（轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)）、抓力測(cè)試于PND28對(duì)子代大鼠進(jìn)行了感覺(jué)運(yùn)動(dòng)行為學(xué)測(cè)試，測(cè)試結(jié)果顯示rhLF組和對(duì)照組之間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3.3.子代大鼠學(xué)習(xí)記憶測(cè)試
　　通過(guò)Morris水迷宮試驗(yàn)，分析重組人乳鐵蛋白對(duì)子代大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，未發(fā)現(xiàn)重組人乳鐵蛋白對(duì)子代大鼠學(xué)習(xí)記憶功能有不良影響（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.與對(duì)照組比較，重組人