一種肺炎鏈球菌溶酶樣假想蛋白質(zhì)SP0987的結(jié)構(gòu)和功能研究.pdf

1、由于抗生素耐藥的增加和疫苗本身存在的缺陷,肺炎鏈球菌的預(yù)防和治療面臨著很大的挑戰(zhàn)。這就需要我們進(jìn)一步深入研究肺炎鏈球菌的致病機理,為抗菌藥物的開發(fā)和疫苗的研制提供理論基礎(chǔ)。前期工作中課題組研究發(fā)現(xiàn),肺炎鏈球菌的一個體內(nèi)誘導(dǎo)基因sp0987編碼的假想蛋白質(zhì)SP0987是一個潛在的毒力因子。到目前為止,SP0987的結(jié)構(gòu)和功能都不清楚,需要我們做進(jìn)一步的研究。
　　 目的：本研究將用X-射線晶體學(xué)方法首次解析假想蛋白質(zhì)SP0987的

2、三維立體結(jié)構(gòu),在結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上研究其生物學(xué)功能,并探索sp0987基因影響細(xì)菌毒力的初步機制。
　　 方法：通過克隆、表達(dá)、純化、蛋白質(zhì)晶體培養(yǎng)、衍射數(shù)據(jù)收集和蛋白質(zhì)三維立體結(jié)構(gòu)解析,得到SP0987的三維立體結(jié)構(gòu);從三維結(jié)構(gòu)所提供的信息,運用酶活性分析方法和定點突變技術(shù)進(jìn)行溶菌酶活性的分析和酶活性位點的分析與驗證;通過熒光報告系統(tǒng)來確定SP0987的細(xì)胞定位;通過構(gòu)建肺炎鏈球菌sp0987缺陷菌株研究小鼠生存實驗及體內(nèi)的定植實驗

3、和體外的細(xì)胞粘附和侵襲實驗,來研究sp0987基因缺陷后對肺炎鏈球菌致病性的影響。
　　 結(jié)果：生物信息學(xué)分析顯示,由基因sp0987編碼的假想蛋白質(zhì)SP0987全長266個氨基酸,其編碼產(chǎn)物可能為溶菌酶,主要作用是降解細(xì)胞壁中N-乙酰胞壁酸和N.乙酰葡糖胺之問的β-1,4-糖苷鍵,屬于GH25家族溶菌酶;通過克隆、表達(dá)、純化、蛋白質(zhì)晶體培養(yǎng)、衍射數(shù)據(jù)收集和蛋白質(zhì)三維立體結(jié)構(gòu)解析,首次成功解析SP0987的三維立體結(jié)構(gòu);序列比對

4、和三維結(jié)構(gòu)疊合分析發(fā)現(xiàn),SP0987是溶菌酶樣蛋白質(zhì),保守性分析及結(jié)構(gòu)特點分析發(fā)現(xiàn)可能的活性位點D33、D131、E133和D222,且都為酸性氨基酸殘基;分子篩實驗提示,SP0987在溶液中以單體形式存在;應(yīng)用綠色熒光蛋白報告系統(tǒng)分析SP0987的細(xì)胞定位,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SP0987定位于細(xì)胞膜,與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致;用LFH-PCR技術(shù)構(gòu)建sp0987缺陷菌,小鼠體內(nèi)生存實驗結(jié)果顯示,sp0987缺陷后肺炎鏈球菌毒力明顯減弱;體外細(xì)胞

5、實驗發(fā)現(xiàn),sp0987缺陷菌對宿主細(xì)胞的侵襲明顯弱于野生菌,而對宿主細(xì)胞的粘附?jīng)]有明顯差異;體內(nèi)定植實驗發(fā)現(xiàn),肺炎鏈球菌D39野生菌及缺陷菌經(jīng)鼻腔感染后,缺陷菌入血時間明顯較晚,且在BALB/c小鼠鼻咽部和肺部的細(xì)菌載量有明顯差異,缺陷菌的細(xì)菌載量明顯減少。
　　 結(jié)論：用X-射線晶體學(xué)方法首次成功解析肺炎鏈球菌假想蛋白質(zhì)SP0987的三維結(jié)構(gòu);結(jié)構(gòu)分析及功能實驗發(fā)現(xiàn),SP0987是溶菌酶樣膜蛋白,在溶液中以單體形式存在;毒力實