S100A8-A9對心肌肥厚預適應的影響.pdf

1、目的:
　　心力衰竭是許多心血管疾病的終末階段，是主要的致死原因。心肌肥厚和心室重塑是心衰進展的主要病理基礎。心肌肥厚是一個復雜的病理過程，以心肌細胞蛋白質(zhì)合成增多和細胞體積增大為特征，逐步進展為不可逆的病理變化。心肌肥厚及心肌重塑在促使心臟結構從可逆到不可逆以及心功能從代償?shù)绞Т鷥數(shù)霓D變中起著重要作用。雖然一定程度的心肌肥厚有利于減輕心室壁壓力，維持負荷加重時的心排出量，然而持續(xù)存在的促肥厚刺激信號促使心肌肥厚加重。提出了一個大

2、膽的假設，即”心肌肥厚預適應”，短期肥厚刺激可以使心臟對后續(xù)持久的肥厚刺激產(chǎn)生抵抗作用，并減緩心衰的進展。在前期實驗中我們已經(jīng)驗證了肥厚預刺激可增強心肌細胞的抗肥厚能力，延緩從心力衰竭的進程，改善心功能，這一作用可能與在解除肥厚刺激因素后S100A8/A9的表達上調(diào)有關，但其在心肌肥厚預適應中的作用機制尚不清楚，而S100A8和S100A9作為鈣結合蛋白S100家族的成員，可能通過Ca2+依賴方式與特異性靶點相互作用發(fā)揮生物活性，Ca2

3、+作為重要的第二信使，在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中起重要作用心肌肥厚的進展中，在Ca2+依賴的心肌肥厚信號通路中，calcineurin-NFAT信號通路是重要的通路之一。因此我們假設S100A8/A9可能通過調(diào)節(jié)calcineurin-NFAT信號通路參與了心肌肥厚預適應。本實驗的研究目的是進一步明確S100A8/A9在心肌肥厚預適應中的表達情況及持續(xù)時間，并通過重組蛋白S100A8/A9和構建重組慢病毒敲低S100A8/A9明確其在心肌肥

4、厚預適應中的作用機制。
　　方法:
　　TAC誘導心肌肥厚預適應對心功能的影響
　　1.1 主動脈弓縮窄術(TAC)誘導小鼠心肌肥厚模型的建立。
　　1.2 超聲心動圖以及左室血流動力學測定心臟結構功能。
　　1.3 Western Blot檢測S100A8/A9蛋白的表達水平。
　　肥厚預適應上調(diào)的S100A8/A9對體外心肌細胞肥厚的作用及機制
　　2.1 去甲腎上腺素刺激新生大鼠心肌細胞(

5、NRCs)。
　　2.2 重組蛋白S100A8/A9對NE刺激的心肌細胞和成纖維細胞的作用。
　　重組慢病毒過表達及敲低S100A8/A9對心肌細胞及成纖維細胞肥厚預適應的作用。
　　3.1 重組慢病毒的構建及鑒定。
　　3.2 細胞活性檢測。
　　3.3 敲低S100A8/A9對心肌細胞和成纖維細胞肥厚預適應的作用。
　　結果:
　　心肌肥厚預適應在體心肌肥厚的保護作用，并上調(diào)S100A8/A

6、9的表達
　　1.1 肥厚預適應改善心功能
　　超聲心動圖檢查結果表明，7d、21d、35dTAC組小鼠左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張/收縮后壁厚度(Pwd/Pws)隨著時間而顯著增加，而左室短軸縮短率(LVFS)明顯下降。(P≤0.001)。與TAC組相比，心肌肥厚預適應組明顯延緩了左室室壁厚度的增加、左室心腔的增大以及心室短軸縮短率的降低（與TAC組相比，P值均＜0.05），而兩個預

7、適應組之間相比沒有統(tǒng)計學差異。TAC6w后，超聲心動圖顯示PRE1+TAC組和PRE2+TAC組小鼠與TAC組相比心臟左室內(nèi)徑(LVD)更?。≒均＜0.05），而左室后壁厚度與TAC組相比沒有統(tǒng)計學差異。（可能與TAC組心腔擴大導致增加的室壁厚度變薄有關）;心臟血流動力學結果顯示PRE1+TAC組和PRE2+TAC組小鼠與TAC組相比左室舒張末壓力(LVEDP)降低和左室收縮力(LV contractility)升高，差異有統(tǒng)計學差異（

8、與TAC組相比，P值均＜0.05），而2個預適應組與TAC組相比左室收縮壓力(LVSP)，左室壓力最大上升速率(LVdp/dt max)左室壓力最大下降速率(LVdp/dt min)沒有統(tǒng)計學差異。
　　1.2 撤除肥厚刺激和肥厚預適應上調(diào)S100A8/A9的表達
　　撤除肥厚刺激對S100A8/A9表達的影響:Western Blot結果證實TAC3d或1w，解除狹窄1d后心肌組織S100A8和S100A9蛋白表達水平顯著

9、升高;
　　肥厚預適應刺激對S100A8/A9表達的影響及持續(xù)時間:肥厚預適應刺激后S100A8以及S100A9的表達明顯升高，同時檢測了S100A8和S100A9表達上調(diào)維持的時間，發(fā)現(xiàn)在T1wD1wT1w以及T1wD1 wT6w兩組中S100A8/A9的表達仍保持升高，證明在恢復肥厚刺激后S100A8/A9能夠維持1-6w的高水平表達。
　　肥厚預適應在體外心肌細胞中上調(diào)S100A8/A9以及重組蛋白S100A8/A9的

10、作用機制
　　2.1 NE預適應刺激心肌細胞上調(diào)S100A8/A9的表達
　　Western blot結果證實預適應1組(PRE1+NE)和NE預適應2組(PRE2+NE)S100A8和S100A9表達較NE組明顯升高，在細胞水平驗證了肥厚預適應刺激可上調(diào)S100A8/A9的表達。
　　2.2 重組蛋白S100A8/A9改善體外心肌肥厚和纖維化
　　在細胞實驗中，我們發(fā)現(xiàn)與NE組相比，重組蛋白S100A8、S10

11、0A9或S100A8/A9處理均可減小心肌細胞面積;RT-PCR結果顯示NE刺激組與對照組相比，心肌細胞ANP、β-MHC以及成纖維細胞procollagenⅠ和Ⅲ的基因表達水平上調(diào)，而給予S100A8、S100A9或S100A8/A9重組蛋白后可以抑制上述基因表達水平;Western blot結果表明NE刺激可以明顯上調(diào)心肌細胞calcineurin的表達，而重組蛋白S100A8、S100A9或S100A8/A9處理后可以抑制這種改變

12、。同時檢測NFATc3在心肌細胞定位，結果顯示對照組NFATc3主要位于細胞漿，NE刺激后轉入細胞核內(nèi)，而給予重組蛋白S100A8、S100A9（或S100A8/A9）均可抑制NE誘導的NFATc3核轉位。
　　重組慢病毒敲低S100A8/A9抵消心肌肥厚預適應的抗肥厚作用
　　上述結果證實了S100A8/A9在心肌肥厚中的重要作用，之后我們構建了過表達和敲低S100A8/A9的重組慢病毒來進一步明確其在心肌肥厚預適應現(xiàn)象中

13、的作用機制。
　　3.1 重組慢病毒的構建和鑒定
　　構建攜帶S100A8(MRP-8)或S100A9(MRP-14)shRNA序列的重組慢病毒敲低S100A8和A9的表達，構建攜帶S100A8(MRP-8)或A9（MRP-14）的重組慢病毒過表達S100A8/A9。免疫熒光證實過表達和敲低S100A8/A9的重組慢病毒有效感染心肌細胞，MOI=5時可以有效感染70％以上的細胞。RT-PCR結果驗證了過表達S100A8和S1

14、00A9重組慢病毒(Lv-S100A8和Lv-S100A9)可上調(diào)S100A8或A9達200多倍以上，顯著高于肥厚預適應上調(diào)的S100A8和S100A9的表達量（約6倍）;RT-PCR和Western Blot均證實重組慢病毒S100A8和S100A9（Lv-ShRNA-S100A8和Lv-ShRNA-S100A9）感染心肌細胞后可明顯抑制S100AS和S100A9的表達。
　　3.2 細胞活性檢測
　　MTT結果顯示高劑量

15、的S100A8和S100A9增加了心肌細胞的死亡，說明S100A8和A9的作用為劑量依賴性。因此，我們選用了敲低S100A8/A9的重組慢病毒來進行后續(xù)的機制研究。
　　3.3 敲低S100A8/A9抵消體外心肌肥厚預適應的抗肥厚作用
　　與預適應組相比，分別或同時敲低S100A8和A9的表達可抵消肥厚預適應作用，增加了心肌細胞面積，上調(diào)心肌細胞ANP和β-MHC的基因表達，增加calcineurin蛋白表達水平和NFAT3

16、的核轉位;并使成纖維細胞procollagenⅠ和Ⅲ的基因表達水平升高。
　　結論:
　　肥厚預適應可上調(diào)S100A8/A9的表達，在恢復肥厚刺激后能夠維持1-6w的高水平表達。體外給予重組蛋白S100A8/A9可以通過抑制calcineurin/NFAT促肥厚信號通路參與肥厚預適應的抗心肌肥厚作用。
　　重組慢病毒敲低S100A8/A9的表達，可抵消心肌肥厚預適應對calcineurin/NFAT促肥厚信號通路的抑制