微流控液滴生成新器件新方法及其在單分子擴增分析與單細胞捕獲研究中的應(yīng)用.pdf

1、單分子、單細胞是生物體系的最基本單位。分子之間的不同決定了其引發(fā)反應(yīng)的不同，細胞之間的不同決定了生命活動的不同。因此，深入研究單分子和單細胞對人們探索生命活動本質(zhì)是十分必要的。與傳統(tǒng)研究對象不同，單個分子、單個細胞的研究需要更加精準的研究平臺，從而避免大背景的干擾，提高信噪比。微流控芯片，是一種將常規(guī)反應(yīng)小型化、集成化新型的技術(shù)。其具有反應(yīng)迅速、反應(yīng)體積小、信噪比高、通量高、結(jié)果精準、試劑節(jié)約等特點，這些優(yōu)點十分符合目前對單分子、單細胞

2、研究的要求。因此在近些年來，微流控芯片技術(shù)在單分子、單細胞分析領(lǐng)域得到廣泛的發(fā)展。
　　雖然微流控平臺在單分子、單細胞的研究領(lǐng)域內(nèi)，已經(jīng)展現(xiàn)了良好的應(yīng)用價值和實用性，但是隨著對單分子、單細胞研究的深入，傳統(tǒng)微流控平臺的一些缺點逐漸顯現(xiàn):昂貴的進樣系統(tǒng)、復(fù)雜的液滴生成操作、芯片內(nèi)產(chǎn)物難以回收、死體積大、單細胞捕獲效率低等。這些問題一直限制著微流控芯片在單分子、單細胞的研究上得到更大的發(fā)展。針對上述問題，本論文嘗試解決困擾微流控平臺的

3、一些問題，論文內(nèi)容主要分為以下三部分:
　　(1)單分子核酸擴增及其在數(shù)字化檢測和功能化產(chǎn)物分析中的應(yīng)用
　　液滴微流控技術(shù)已經(jīng)在單分子核酸擴增中顯示出強大的應(yīng)用前景。液滴微流控芯片降低了單分子核酸擴增時的腔體體積、提高了反應(yīng)腔體的通量，并且將數(shù)字化檢測成為可能。為了克服微流控技術(shù)一直存在的耗時長、兼容性差、易融合、產(chǎn)物回收難等問題，發(fā)展了一種高通量液滴生成微陣列芯片，用于實現(xiàn)芯片內(nèi)的單分子核酸擴增，數(shù)字化檢測超低濃度核酸等

4、目的。利用該芯片，我們實現(xiàn)了對單分子克隆產(chǎn)物進行有效的回收、貯存和后續(xù)分析。我們使用單核酸擴增的方式，將單克隆產(chǎn)物直接與靶標結(jié)合，考察結(jié)合強度，從而直接得到結(jié)合力強的單克隆產(chǎn)物，大大簡化了傳統(tǒng)核酸適體篩選需要對分子庫測序及大量合成的不足。該單分子核酸擴增方法對功能化單克隆的產(chǎn)物分析、核酸測序和后續(xù)分析儀器兼容性方面也具有極大的應(yīng)用價值。
　　(2)非泵型高通量液滴生成微流控芯片
　　傳統(tǒng)微流控液滴生成方式已經(jīng)成功在單分子、單

5、細胞研究上取得一定的成果，然而傳統(tǒng)的液滴生成方式，往往依賴于進樣泵對芯片內(nèi)流體進行精密地控制。這增加了液滴的生成成本和復(fù)雜程度，限制了液滴在多種生物分析領(lǐng)域的應(yīng)用。如何克服液滴生成過程中對儀器的依賴，簡化液滴生成操作，成為擴大其應(yīng)用范圍的關(guān)鍵。為此，我們開發(fā)兩種非泵型微流控芯片，只需簡單操作即可形成高通量的液滴的芯片，其分別采用離心式和按壓式進行液滴生成。離心式液滴生成芯片，使用離心力控制流體間壓力，通過油水界面處的特殊結(jié)構(gòu)，利用表面張

6、力生成液滴。該方法生成簡便，液滴直徑均一可控，液相無死體積殘留。這些優(yōu)點克服了傳統(tǒng)液滴生成方式的一些弊端，為后續(xù)將該方法應(yīng)用在單細胞測序等領(lǐng)域提供了一定基礎(chǔ)。按壓式瓊脂糖液滴生成方式，通過將液態(tài)瓊脂糖按壓入預(yù)制的PDMS陣列芯片內(nèi)，我們可以高通量地生成直徑均一可控的液滴。而且液滴固定在PDMS陣列中，解決了傳統(tǒng)液滴隨油相飄動難以長期對特定液滴觀察的缺點。此外，利用瓊脂糖固-液轉(zhuǎn)換的特點，瓊脂糖液滴可轉(zhuǎn)化為瓊脂糖微球，從而實現(xiàn)單一微球的回

7、收與樣品的進一步分析的目的。
　　(3)基于流體力學(xué)設(shè)計的單細胞高效捕獲微流控芯片
　　單細胞做為人們研究的熱點，其分離與捕獲一直是人們所急需解決的問題。由于單細胞體積小，形狀不規(guī)則性，如何高效地分離并捕獲單細胞成為一項艱巨的任務(wù)。針對這一問題，作者設(shè)計一款用于高效單細胞捕獲的芯片。該芯片使用簡便，單細胞捕獲捕獲效率高、捕獲速度快?；诹黧w力學(xué)計算優(yōu)化的芯片結(jié)構(gòu)，細胞捕獲效率可以高達91％，單細胞捕獲效率高于70％，該方法克