核酸的電、磁純化新方法及其在微流控芯片中的應(yīng)用研究.pdf

1、微全分析系統(tǒng)(μ-TAS)具備在芯片實(shí)驗(yàn)室上實(shí)現(xiàn)分析過(guò)程集成化、自動(dòng)化和縮微化的特點(diǎn)，能夠極大地減少試劑的消耗量、縮短分析時(shí)間、提高分析檢測(cè)效率。因此，在疾病診斷、生化分析、臨床檢測(cè)等領(lǐng)域獲得了普遍關(guān)注。通過(guò)不同功能芯片的使用，達(dá)到分析全過(guò)程多種功能的集成，是實(shí)現(xiàn)微全分析系統(tǒng)集成化的有效途徑之一。針對(duì)復(fù)雜生化樣品體系，樣品預(yù)處理是實(shí)現(xiàn)整個(gè)μ-TAS分析的前提，而目前樣品預(yù)處理技術(shù)正成為μ-TAS向集成化、高效率、連續(xù)化發(fā)展必須突破的瓶頸

2、之一。 在基因分析和疾病檢測(cè)中，常常需要進(jìn)行DNA提取、DNA擴(kuò)增和DNA分離檢測(cè)等步驟，其中DNA的提取是決定基因分析成敗與質(zhì)量的關(guān)鍵步驟。傳統(tǒng)的核酸提取方法具有操作繁瑣，難以自動(dòng)化等缺點(diǎn)。固液雙相分離富集是一種既可實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的濃縮富集又能夠去除雜質(zhì)組分干擾的樣品預(yù)處理技術(shù)，而且它比較容易與微流控芯片系統(tǒng)結(jié)合實(shí)現(xiàn)在線預(yù)處理。 本論文發(fā)展了兩種可用于捕獲濃縮生物樣品中DNA的固液雙相分離富集方法--電滲析分離富集與磁珠法

3、固相萃取，并把兩種方法集成至微流控芯片中，實(shí)現(xiàn)生物樣品的在線預(yù)處理，芯片易與其他芯片聯(lián)用。論文共分為四章。 第一章為緒論，首先總結(jié)了DNA提取的一般過(guò)程與幾種傳統(tǒng)的DNA提取方法；然后介紹了膜分離技術(shù)尤其是電滲析技術(shù)及其在生物分離領(lǐng)域的應(yīng)用；接著概述了磁性復(fù)合納米顆粒的制備方法及其在DNA萃取中的應(yīng)用；最后，論述膜分離技術(shù)與固相萃取技術(shù)在樣品預(yù)處理微流控芯片中的集成和應(yīng)用。 第二章構(gòu)建一個(gè)可用于濃縮生物大分子(DNA)的

4、電滲析裝置?；陔姖B析技術(shù)，利用陽(yáng)離子交換膜在電場(chǎng)中對(duì)負(fù)電性物質(zhì)的截留特性，在流路死體積中捕獲并濃縮負(fù)電性物質(zhì)。以陰性染料達(dá)旦黃作為探討富集機(jī)理的模型化合物，研究了負(fù)電性物質(zhì)在裝置中的運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)，并初步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。生物大分子樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本裝置在低電壓條件下成功地實(shí)現(xiàn)無(wú)損傷捕獲濃縮DNA分子，單體系的λ--DNA實(shí)驗(yàn)回收率約47％，濃縮液可直接用于PCR實(shí)驗(yàn)；裝置具備較好的分離效能：從DNA-血紅蛋白的混合體系中選擇性地捕獲濃縮D

5、NA，去除絕大部分的蛋白質(zhì)，濃縮液可直接用于PCR實(shí)驗(yàn)；從全血破碎液中成功地萃取出基因組DNA，二次濃縮液可用于PCR實(shí)驗(yàn)。本電滲析裝置適用于分離具備不同電性的生物大分子，如等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)或核酸，實(shí)驗(yàn)操作自動(dòng)簡(jiǎn)便，使用簡(jiǎn)單的有機(jī)試劑；也可用于一般的無(wú)機(jī)離子和生物小分子的純化與預(yù)富集以降低對(duì)儀器的檢測(cè)限要求；微型化可與微流控芯片聯(lián)用或集成于芯片上，在生物樣品的捕獲、脫鹽和分離等預(yù)處理過(guò)程中有很大的應(yīng)用空間。 第三章發(fā)展了可控表

6、面電性的超順磁氨基化SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒(Amino-Si-MNPs)用于核酸的分離純化。采用水熱法制備超順磁的Fe3O4納米粒子，通過(guò)SEM、TEM、XRD和MPMS超導(dǎo)量子干涉磁強(qiáng)計(jì)對(duì)其進(jìn)行表征；運(yùn)用Stober法對(duì)Fe3O4納米粒子進(jìn)行包覆得到粒徑約300nm，具有核殼結(jié)構(gòu)的SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒；基于硅烷試劑的水解，利用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)對(duì)SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒進(jìn)行氨基化表面改性

7、，得到Amino-Si-MNPs。借助ZETA電位研究磁珠的表面電性，發(fā)現(xiàn)氨基化磁珠的表面電性對(duì)溶液的pH敏感，通過(guò)研究磁珠在萃取DNA體系中的電性，提出磁珠與DNA分子結(jié)合的機(jī)理。利用該磁珠成功地從全血中萃取得到基因組DNA，實(shí)驗(yàn)僅使用簡(jiǎn)單的、不對(duì)PCR產(chǎn)生干擾和抑制的試劑，萃取效率約70％，洗提液可直接用于PCR試驗(yàn)。本磁珠除了具有超順磁性、分散性好等優(yōu)點(diǎn)之外，其表面電性可通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH得到控制、磁珠與DNA分子作用時(shí)，吸附和脫

8、附速率快。這些優(yōu)勢(shì)使其成為一種良好的固定相，在DNA萃取等生物分離過(guò)程、在樣品預(yù)處理芯片中具有廣闊的應(yīng)用前景。 第四章制作了兩個(gè)基于固液雙相分離富集技術(shù)的樣品預(yù)處理芯片。其一把第二章基于電滲析技術(shù)的裝置微型化并集成至微流控芯片中。以PMMA為材料，用激光刻蝕溝道，制作一個(gè)“三明治”式的分離濃縮芯片，陽(yáng)離子膜依靠機(jī)械力固定于兩層芯片間。在線觀測(cè)達(dá)旦黃在芯片上的富集特性；以花菁類染料(Gene-finder)為熒光指示劑，在線監(jiān)測(cè)D

9、NA在該芯片中的富集特性。利用單體系DNA與DNA-血紅蛋白混合體系研究芯片的濃縮和分離效能，結(jié)果表明：該芯片能夠無(wú)損傷地捕獲濃縮單體系與混合物體系中的DNA，濃縮液可直接供給PCR試驗(yàn)；在全血中基因組的提取實(shí)驗(yàn)中，該芯片能夠捕獲濃縮裂解液中的基因組DNA，但是純度較低。芯片自動(dòng)化程度高，試劑用量少等特點(diǎn)使具有與其他芯片聯(lián)用的潛力，如與PCR芯片聯(lián)用，用于分離PCR產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)；或與其他萃取芯片聯(lián)用用于提取液的脫鹽，濃縮等處理。

10、 另一芯片基于第三章表面電性可控的氨基化磁珠技術(shù)，磁珠作為固定相填充于DNA萃取芯片中，借助外磁場(chǎng)固定于微通道中。芯片成功地從全血裂解液中萃取得到基因組DNA，洗提液可直接用于PCR實(shí)驗(yàn)。與傳統(tǒng)的固相萃取芯片相比，磁珠芯片制作工藝要求低，磁珠填充與去除方便，試劑用量少、洗提液可直接用于進(jìn)一步的生物分析等優(yōu)勢(shì)使該芯片具有與細(xì)胞破碎芯片、PCR芯片等聯(lián)用的發(fā)展前景。 本論文發(fā)展的兩種固液雙相分離富集方法；把電滲析技術(shù)用于生物大分子