基于功能化納米材料和微流控芯片的生化分析新方法研究.pdf

1、納米材料由于具有獨(dú)特的光學(xué)、電化學(xué)、催化性能以及良好的生物相容性，已被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中。在生化分析領(lǐng)域，將納米材料應(yīng)用于生物傳感器的制備可以顯著提高傳感器的分析性能。至今，基于納米材料的生物傳感器（納米生物傳感器）已被應(yīng)用于DNA、蛋白質(zhì)、多肽等多種生物分子的檢測，并在生化分析領(lǐng)域顯示了十分誘人的應(yīng)用前景。盡管如此，相對于傳統(tǒng)生物傳感技術(shù)，納米生物傳感器尚處于起步階段。在利用納米材料構(gòu)建生物傳感器的過程中，關(guān)鍵的一步在

2、于如何將納米材料的優(yōu)勢與生物識別事件相結(jié)合。因此，設(shè)計(jì)和構(gòu)建靈敏度更高、選擇性更好的納米生物傳感器仍是生物傳感領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
　　 芯片電泳(MCE)是微流控芯片技術(shù)的重要組成部分，也是近年來發(fā)展最快的分離分析技術(shù)之一。與傳統(tǒng)分離技術(shù)相比，MCE具有操作簡單、分離效率高、分析速度快、試劑和樣品消耗量少、易于集成化和自動化等優(yōu)點(diǎn)。正是由于這些獨(dú)特的優(yōu)勢，MCE已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于小分子、DNA和蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)的分離和檢測。相對于傳

3、統(tǒng)分離技術(shù)如高效液相色譜和氣相色譜，MCE技術(shù)尚不成熟，而且目前所建立的大多數(shù)MCE分析方法無法應(yīng)用于實(shí)際樣品特別是生物樣品分析。因此，建立高靈敏的MCE分析方法，并應(yīng)用于生物樣品分析，對于推動生物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，具有十分重要的意義。
　　 基于以上考慮，本論文利用幾種納米材料如納米金(AuNPs)、二氧化硅納米粒子(SiO2 NPs)、量子點(diǎn)(QDs)的獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)，發(fā)展了幾種新型光學(xué)生物傳感技術(shù);此外，利用MCE技術(shù)建

4、立了一系列用于檢測復(fù)雜生物樣品中痕量物質(zhì)的新方法。具體內(nèi)容如下:
　　 1.基于功能化納米材料的生物檢測新體系研究
　　 (1)基于AuNPs能夠增強(qiáng)熒光偏振的原理，以EcoRⅠ酶為模型分析物，發(fā)展了一種簡單、超靈敏檢測核酸內(nèi)切酶的熒光偏振生物傳感器。首先在納米金表面修飾具有捕獲功能的DNA，再與熒光標(biāo)記的部分互補(bǔ)DNA雜交，形成具有EcoRⅠ酶識別位點(diǎn)的雙鏈DNA功能化納米探針。當(dāng)EcoRⅠ酶存在時，納米探針表面的雙鏈

5、DNA被EcoRⅠ酶選擇性切斷，釋放出更短的熒光標(biāo)記的DNA片段，從而導(dǎo)致熒光偏振值（P）減小。根據(jù)P值的變化可以定量分析EcoRⅠ酶的活性。此傳感器不僅具有較寬的檢測范圍和很低的檢測限，而且選擇性很高。此外，它還可以用于核酸內(nèi)切酶抑制劑的篩選。
　　 (2)基于核酸適體構(gòu)型轉(zhuǎn)換觸發(fā)納米粒子信號放大的原理，利用三磷酸腺苷(ATP)作為模型分析物，構(gòu)建了一種檢測生物分子的熒光偏振適體傳感器。該傳感體系以熒光標(biāo)記的發(fā)夾式核酸適體作為

6、分子識別探針和檢測探針，單鏈DNA修飾的SiO2 NPs作為信號放大探針。當(dāng)沒有目標(biāo)分子存在時，熒光標(biāo)記的發(fā)夾式核酸適體不會與納米粒子功能化的DNA結(jié)合，此時體系的P值很小。當(dāng)加入ATP后，它與核酸適體結(jié)合使發(fā)夾式結(jié)構(gòu)打開，且打開的發(fā)夾式核酸適體能與納米粒子功能化的DNA雜交，從而導(dǎo)致體系的P值增大。據(jù)此可用于定量檢測ATP，檢測范圍為40 pmol/L～100μmol/L。該方法不需要復(fù)雜的分離、洗滌步驟，整個過程都在均相中完成。通過

7、改變適體的堿基序列，該方法很容易用于蛋白質(zhì)、金屬離子及其它小分子物質(zhì)的分析。
　　 (3)基于DNA切割反應(yīng)的特異性和AuNPs的超高熒光猝滅能力，以EcoRⅠ酶、EcoRⅤ酶和HaeⅢ酶為模型分析物，構(gòu)建了一種能同時高靈敏檢測多種核酸內(nèi)切酶的多色納米分子信標(biāo)。在該體系中，三種標(biāo)記了不同熒光染料的發(fā)夾式DNA（酶底物）通過金-硫的親和作用共同組裝在AuNPs表面形成多色納米分子信標(biāo)。由于自組裝作用拉近了AuNPs與熒光染料的距離

8、，因此所有熒光染料的熒光通過納米表面能量轉(zhuǎn)移被猝滅。當(dāng)目標(biāo)核酸內(nèi)切酶存在時，它們能選擇性切斷發(fā)夾式DNA，釋放出游離的熒光標(biāo)記DNA片段，從而導(dǎo)致相應(yīng)熒光染料的熒光恢復(fù)。據(jù)此可以實(shí)現(xiàn)多種核酸內(nèi)切酶活性的同時檢測。所建立的方法具有檢測范圍寬、靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。此外，基于核酸內(nèi)切酶抑制劑對DNA切割反應(yīng)的抑制作用，該方法還可以用于核酸內(nèi)切酶抑制劑的篩選。
　　 (4)利用QDs的獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)，結(jié)合分子間及分子內(nèi)猝滅劑的高效熒

9、光猝滅能力，構(gòu)建了一種新型納米探針用于核酸內(nèi)切酶檢測及抑制劑篩選。在該探針中，熒光猝滅劑通過與酶底物DNA片段的直接標(biāo)記和互補(bǔ)DNA雜交方式連接到QDs表面。在沒有核酸內(nèi)切酶存在時，QDs的熒光通過能量轉(zhuǎn)移被猝滅，納米探針處于“關(guān)閉”狀態(tài)。當(dāng)體系中存在目標(biāo)核酸內(nèi)切酶時，QDs表面的雙鏈DNA被切斷，猝滅劑脫離QDs表面而使QDs的熒光恢復(fù)。QDs的熒光增強(qiáng)幅度與核酸內(nèi)切酶含量有關(guān)，據(jù)此可以用于核酸內(nèi)切酶活性的分析。采用不同發(fā)射波長的QD

10、s和對應(yīng)的猝滅劑，該方法可以實(shí)現(xiàn)多種核酸內(nèi)切酶的同時檢測。此外，基于核酸內(nèi)切酶抑制劑能夠抑制酶切反應(yīng)，該方法還可以用于核酸內(nèi)切酶抑制劑的篩選。
　　 2.基于芯片電泳的生物檢測新方法研究
　　 (1)以熒光素異硫氰酸酯(FITC)為柱前衍生試劑，采用自制的玻璃/聚二甲基硅氧烷(PDMS)復(fù)合芯片，結(jié)合芯片電泳激光誘導(dǎo)熒光(MCE-LIF)檢測技術(shù)，建立了一種簡單、快速、靈敏檢測生物樣品中D-酪氨酸的新方法。該方法以γ-環(huán)

11、糊精為手性選擇劑，結(jié)合膠束電動色譜分離模式，通過優(yōu)化分離條件，在150 s內(nèi)實(shí)現(xiàn)了D/L-酪氨酸對映體的快速分離，D-酪氨酸的檢測限達(dá)到了33 nmol/L。利用該方法對正常人與腎衰竭病人血漿中D-酪氨酸的含量進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示腎衰竭病人血漿中D-酪氨酸的含量明顯高于正常人。該方法可用于腎衰竭病疾病的臨床診斷。
　　 (2)采用集成柱前微反應(yīng)器和柱后微反應(yīng)器的玻璃/PDMS復(fù)合芯片，提出了一種在線衍生-MCE-化學(xué)發(fā)光(CL)

12、檢測新技術(shù)，并將其應(yīng)用于巰基類化合物的測定。該方法將衍生反應(yīng)、進(jìn)樣、電泳分離和CL檢測集成在同一片芯片中進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)了高度的集成化和自動化。以N-(4-氨基丁基)-N-乙基-異魯米諾(ABEI)和鄰苯二醛(OPA)為在線衍生試劑，卡托普利、硫普羅寧、硫鳥嘌呤和6-巰基嘌呤等四種巰基類藥物為模型分析物，采用膠束電動色譜分離模式，在80 s內(nèi)完成了四種藥物的分離和同時檢測。該方法具有很高的靈敏度，四種巰基類藥物的檢測限在8.9～13.5 nm

13、ol/L范圍。利用該方法對人血漿樣品中巰基類藥物的含量進(jìn)行了測定。
　　 (3)采用MCE-LIF或CL檢測技術(shù)，建立了快速檢測生物樣品中痕量物質(zhì)的免疫分析新方法。該方法采用競爭免疫模式，以熒光或CL標(biāo)記的抗原為示蹤劑，與游離抗原（分析物）競爭結(jié)合有限量的抗體，免疫反應(yīng)后進(jìn)行電泳分離檢測。利用所建立的方法分別對人血漿中苯巴比妥(PB)和人血清中睪酮(T)的含量進(jìn)行了測定。與常規(guī)免疫分析方法相比，該方法具有簡單、快速、靈敏度高、成

14、本低等優(yōu)點(diǎn)。
　　 (4)采用玻璃微珠作為抗體固定介質(zhì)，結(jié)合MCE-LIF檢測技術(shù)，發(fā)展了一種多元免疫分析方法。該方法將表面固定有不同抗體的多種玻璃微珠、多種熒光標(biāo)記的抗原和游離抗原（分析物）同時置于芯片的樣品池中進(jìn)行免疫反應(yīng)，然后進(jìn)樣、分離和檢測。由于玻璃微珠的引入，免疫復(fù)合物不能進(jìn)入分離通道，從而使分離變得更簡單。此外，該方法只需單一檢測器和單一熒光標(biāo)記試劑即可完成多種物質(zhì)的同時免疫檢測，降低了分析成本。以PB、苯妥英(PH