創(chuàng)傷涂膜劑的藥理學(xué)研究及安全性評(píng)價(jià).pdf

1、目的：創(chuàng)傷涂膜劑是由白求恩國(guó)際和平醫(yī)院藥劑科自主研發(fā)的一種具有鎮(zhèn)痛、抑菌和抗感染作用的新型復(fù)方涂膜劑，主藥成分包括替硝唑、鹽酸達(dá)克羅寧和醋酸氯己定等。本研究的主要目的是對(duì)該制劑的藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和安全性進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，包括鎮(zhèn)痛試驗(yàn)、體外抑菌試驗(yàn)、在體抗感染試驗(yàn)、藥代動(dòng)力學(xué)研究、皮膚刺激試驗(yàn)、急性毒性和長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，為報(bào)批臨床研究提供數(shù)據(jù)支持。同時(shí)結(jié)合該制劑的劑型特點(diǎn)，對(duì)其在血液和皮膚組織的藥代動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行深入細(xì)致的研究，為臨床應(yīng)用選

2、擇合適的用法用量提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　鎮(zhèn)痛試驗(yàn)采用豚鼠背部皮膚燙傷和小鼠尾部福爾馬林刺激兩種致痛模型，并與鹽酸達(dá)克羅寧膠漿劑進(jìn)行比較。將80℃水浴中加熱至平衡的砝碼在豚鼠裸露背部皮膚燙5 s制備燙傷模型。豚鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，分別是空白對(duì)照組(基質(zhì)組)，創(chuàng)傷涂膜劑低、中、高3個(gè)劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組(鹽酸達(dá)克羅寧膠漿)，以20μL/cm2的劑量涂抹藥物或基質(zhì)，采用針刺法進(jìn)行痛覺測(cè)定，評(píng)價(jià)指標(biāo)為平均起效時(shí)間、平均持

3、續(xù)時(shí)間、有效率。鼠尾福爾馬林試驗(yàn)分組同豚鼠試驗(yàn)，每組12只。將小鼠尾部浸入藥液3 min后，皮內(nèi)注射20％福爾馬林溶液20μL，然后觀察并記錄小鼠舔舐注射部位及尾根部的時(shí)間(sec)。
　　體外抑菌試驗(yàn)采用試管二倍稀釋法，對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、奇異變形桿菌四種需氧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，脆弱擬桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌兩種厭氧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和200種臨床分離菌株進(jìn)行了體外抑菌效果的評(píng)價(jià)，分別測(cè)定了創(chuàng)傷涂膜劑的最低抑菌濃度(MIC)、

4、最低殺菌濃度(MBC)，同時(shí)考察了pH值、細(xì)菌接種量、血清蛋白、附加藥物對(duì)MIC的影響。
　　在藥代動(dòng)力學(xué)研究中，首先建立同時(shí)測(cè)定替硝唑、達(dá)克羅寧、氯己定濃度的HPLC/MS/MS分析方法，條件如下：色譜柱為Phenomenex GeminiC18(50 mm×2.0 mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-10 mmol·L-1甲酸銨(含0.2%甲酸)(56:44，v/v)，流速0.2 mL·min-1，柱溫25℃，通過電噴霧離子化(ES

5、I)三級(jí)四極桿串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行正離子多反應(yīng)選擇監(jiān)測(cè)(MRM)。用該法分別測(cè)定了大鼠血漿和皮膚微透析樣品的藥物濃度變化情況。實(shí)驗(yàn)前一天，將大鼠背部皮膚用電動(dòng)剃毛器脫毛，給藥前用砂紙摩擦至滲血制備破損皮膚模型，按20μL/cm2的給藥劑量涂于3 cm×3 cm的創(chuàng)面，測(cè)定給藥后0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，10，12，14，24 h血漿中的藥物濃度經(jīng)時(shí)變化情況，用DAS2.0.1程序進(jìn)行數(shù)據(jù)的模擬分析。利用在體皮膚微透析技術(shù)

6、，以5%的葡萄糖溶液(含0.1%甲酸)作為灌流液，使用線性微透析探針，在1.5μL·min-1灌流速度下收集樣品，每20 min收集一次，持續(xù)12 h，透析液樣品直接進(jìn)行HPLC/MS/MS分析，研究了創(chuàng)傷涂膜劑中各藥物成分在皮膚組織的實(shí)時(shí)濃度變化情況。
　　皮膚刺激試驗(yàn)以家兔為模型，分為完整皮膚和破損皮膚組，進(jìn)行了單次和多次給藥試驗(yàn)。給藥前將兔的背部脫毛，給藥面積左右各3 cm×3cm。實(shí)驗(yàn)采用同體左右側(cè)自身比較，將0.5 mL

7、受試藥物涂布于左側(cè)，右側(cè)涂布同體積溶劑作為對(duì)照。破損皮膚組給藥前使用高壓滅菌砂紙磨擦用藥部位以滲血為度。單次給藥試驗(yàn)持續(xù)24 h，多次給藥試驗(yàn)每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。給藥結(jié)束后用滅菌水清潔給藥部位除去藥物，分別于除去藥物后1 h、24 h、48 h和72 h，肉眼觀察并記錄涂敷部位有無紅斑和水腫等情況，并進(jìn)行刺激反應(yīng)評(píng)分。如存在持久性損傷，則延長(zhǎng)觀察至14 d，每天觀察一次。對(duì)出現(xiàn)中度及以上皮膚刺激性的動(dòng)物，在觀察期結(jié)束時(shí)對(duì)給藥局部

8、取材，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
　　毒性試驗(yàn)包括急性毒性和長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)。采用大鼠背部皮膚給藥方法，給藥面積兩側(cè)各5 cm×4 cm，給藥量20μL/cm2/次。急性毒性試驗(yàn)設(shè)8個(gè)試驗(yàn)組，每組10只，分別是完整皮膚高劑量涂膜劑組，破損皮膚高、中、低3個(gè)劑量的復(fù)方涂膜劑組，3個(gè)高濃度的單方涂膜劑組和溶劑對(duì)照組，共給藥2次，間隔6 h；長(zhǎng)毒試驗(yàn)設(shè)9個(gè)試驗(yàn)組，比急毒試驗(yàn)增加一個(gè)完整皮膚空白對(duì)照組，每天給藥1次，連續(xù)給藥4周。每次給藥前用溫?zé)嶂?/p>

9、37℃無菌蒸餾水除去殘留受試物。試驗(yàn)過程中每天記錄大鼠反應(yīng)情況，試驗(yàn)結(jié)束后，所有動(dòng)物被處死，做相應(yīng)的血液、解剖學(xué)和組織病理學(xué)檢查。
　　結(jié)果：
　　鎮(zhèn)痛試驗(yàn)：豚鼠背部皮膚燙傷試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組的有效鎮(zhèn)痛時(shí)間范圍為：高劑量組>中劑量組>低劑量組>陽(yáng)性對(duì)照組。成組t檢驗(yàn)分析顯示，創(chuàng)傷涂膜劑各劑量組在起效時(shí)間、持續(xù)時(shí)間和有效率方面均明顯優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)，各組鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)弱順序依次為：高劑量組>中劑量組>低劑量組>陽(yáng)性對(duì)照

10、組。由鎮(zhèn)痛有效率的卡方分析可知，四個(gè)藥物組鎮(zhèn)痛作用的有效率差異顯著；創(chuàng)傷涂膜劑各劑量組均與陽(yáng)性對(duì)照組的總體有效率差異顯著，且均高于陽(yáng)性對(duì)照組；創(chuàng)傷涂膜劑各劑量組間的有效率差異顯著。創(chuàng)傷涂膜劑三個(gè)劑量組呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r=0.9679。鼠尾福爾馬林試驗(yàn)中，創(chuàng)傷涂膜劑各劑量組的小鼠舔尾時(shí)間與空白對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05或P<0.01)，與陽(yáng)性對(duì)照組相比也明顯減少。
　　體外抑菌試驗(yàn)：創(chuàng)傷涂膜劑對(duì)所考察的6種標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC

11、和MBC如下：金黃色葡萄球菌0.0625，0.125μg·mL-1；大腸埃希氏菌2，2μg·mL-1；銅綠假單胞菌4，4μg·mL-1；奇異變形桿菌8，8μg·mL-1；脆弱擬桿菌1，1μg·mL-1；產(chǎn)氣莢膜梭菌1，2μg·mL-1。培養(yǎng)基pH5.0和7.0時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、脆弱擬桿菌MIC無影響；pH9.0時(shí)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌MIC降低，脆弱擬桿菌不生長(zhǎng)；對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌MIC影響不同。細(xì)菌接種量105 CF

12、U·mL-1和107 CFU·mL-1時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、脆弱擬桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌MIC均無影響；接種量103 CFU·mL-1時(shí)四種標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC均有所降低。含25%的胎牛血清營(yíng)養(yǎng)肉湯，對(duì)脆弱擬桿菌MIC無影響，含量為50%、75%時(shí)，脆弱擬桿菌MIC均升高；以上三種含量的胎牛血清營(yíng)養(yǎng)肉湯，對(duì)金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌MIC均升高，銅綠假單胞菌均>32μg·mL-1。
　　藥代動(dòng)力學(xué)研究：使用本實(shí)驗(yàn)建立的液質(zhì)分析

13、方法，空白血漿及空白透析液中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)物的測(cè)定，血漿中替硝唑、達(dá)克羅寧、氯己定的線性范圍均為2～1000 ng·mL-1，日內(nèi)RSD均<11.0%，日間RSD均<14.1%，準(zhǔn)確度在-7.2～2.9%范圍內(nèi)，提取回收率均>80%，在室溫放置24 h、-20℃凍存3 d、凍融3次所測(cè)得的RE%均在±15%以內(nèi)。微透析液中三種藥物的線性范圍均為1～200 ng·mL-1，日內(nèi)RSD均<6.9%，日間RSD均<12.8%，準(zhǔn)確度在-

14、5.0～2.7%范圍內(nèi)，在室溫放置24 h、0～4℃冷藏3d所測(cè)得的RE%均在±15%以內(nèi)。兩種樣品的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果均符合目前生物樣品的測(cè)定要求。
　　創(chuàng)傷涂膜劑在大鼠背部破損皮膚，按20μL/cm2劑量給藥后，替硝唑、達(dá)克羅寧、氯己定在血漿中的達(dá)峰濃度分別為(97.59±47.74)、(20.34±14.20)、(10.00±5，54)ng·mL-1；達(dá)峰時(shí)間分別為(1.33±0.41)、(1.67±0.26)、(1.42±0.

15、38)h；AUC0-24h分別為(376.25±53.27)、(63.41±27.15)、(69.52±29.02)ng·h·mL-1，血藥濃度數(shù)據(jù)經(jīng)DAS軟件模擬，符合二室模型。同時(shí)采用微透析技術(shù)測(cè)得皮膚組織中的藥物達(dá)峰濃度分別為(363.24±276.03)、(419.33±184.85)、(15.26±6.51)ng·mL-1；達(dá)峰時(shí)間分別為(1.17±0.55)、(1.28±0.39)、(1.28±0.39)h；AUC(0-24

16、h)分別為(606.12±225.44)、(871.36±369.31)、(78.45±36.82)ng·h·mL-1。
　　創(chuàng)傷涂膜劑單次和多次給藥皮膚刺激試驗(yàn)：全部動(dòng)物(包括完整皮膚組和破損皮膚組)，給藥側(cè)與對(duì)照側(cè)相比，無明顯差異，均未見紅斑、水腫，兩側(cè)皮膚刺激評(píng)分均為0。
　　急性毒性試驗(yàn)：完整皮膚給藥后全部動(dòng)物未見明顯異常表現(xiàn)，創(chuàng)傷涂膜劑的最大無毒性反應(yīng)劑量(以達(dá)克羅寧的含量計(jì)算)為0.4 mg/cm2。在破損皮膚給

17、藥的動(dòng)物中，創(chuàng)傷涂膜劑的最大無毒性反應(yīng)劑量(NOAEL)為0.2mg/cm2，最小毒性反應(yīng)劑量(LOAEL)在0.2～0.4mg/cm2范圍內(nèi)。創(chuàng)傷涂膜劑高劑量組中有8只動(dòng)物于給藥后8 min～40 min依次出現(xiàn)自發(fā)活動(dòng)減少、俯臥不動(dòng)，站立行走不穩(wěn)，側(cè)臥不動(dòng)，上述表現(xiàn)均在給藥后50 min～1 h內(nèi)恢復(fù)。鹽酸達(dá)克羅寧組動(dòng)物給藥后6 min～19 min出現(xiàn)相似的表現(xiàn)，于給藥后50 min～1.5 h恢復(fù)。其余各組動(dòng)物均未見明顯異常表現(xiàn)

18、。給藥后第14 d大體解剖，所有動(dòng)物肉眼觀察各臟器均未見明顯異常改變。
　　長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)：在連續(xù)4周的給藥和2周的恢復(fù)期間，未發(fā)生與藥物毒性相關(guān)的動(dòng)物死亡。在第一次給藥后，創(chuàng)傷涂膜劑高、中、低劑量組、各單方組與溶劑對(duì)照組比較，動(dòng)物均出現(xiàn)自發(fā)活動(dòng)減少，鹽酸達(dá)克羅寧組部分動(dòng)物甚至出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)失調(diào)和強(qiáng)直性抽搐，癥狀持續(xù)時(shí)間約1 h。但是出現(xiàn)這些癥狀的時(shí)間逐日縮短，至第4周時(shí)，各組給藥后均未見異常表現(xiàn)。給藥期間，各給藥組雄性動(dòng)物體重明顯減輕，

19、但試驗(yàn)結(jié)束后可以恢復(fù)，雌性動(dòng)物鹽酸達(dá)克羅寧單方組腎上腺重量及腎上腺/體重系數(shù)明顯增加，試驗(yàn)結(jié)束后亦可恢復(fù)，這兩種現(xiàn)象考慮與操作應(yīng)激有關(guān)。其余各組一般體征、體重、攝食量、血液學(xué)、血液生化及組織病理學(xué)檢查均未見明顯異常。
　　結(jié)論：
　　豚鼠背部皮膚燙傷和小鼠尾部福爾馬林刺激試驗(yàn)結(jié)果表明，創(chuàng)傷涂膜劑對(duì)物理刺激和化學(xué)刺激引起的動(dòng)物皮膚損傷有顯著的鎮(zhèn)痛作用，并呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，與達(dá)克羅寧膠漿劑相比，涂膜劑的鎮(zhèn)痛效果更好。
　

20、　體外抑菌試驗(yàn)表明該制劑對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有良好的抑菌效果。
　　建立的同時(shí)測(cè)定替硝唑、達(dá)克羅寧、氯己定濃度的HPLC/MS/MS分析方法，靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，能夠滿足大鼠在體皮膚微透析樣品和血漿樣品中三種藥物的測(cè)定要求；大鼠破損皮膚給藥后，血液和皮膚組織中藥物的吸收速度相似，但皮膚組織中替硝唑和達(dá)克羅寧的濃度均明顯高于血液中的藥物濃度，有利于發(fā)揮局部抗菌和鎮(zhèn)痛作用，氯己定在血液和皮膚組織中的吸收程度均較小。