PT8A佐劑多肽與重組輪狀病毒VP8-亞單位融合蛋白的免疫效應(yīng)研究.pdf

1、輪狀病毒（Rotavirus,RV）是引起嬰幼兒腹瀉進(jìn)而死亡的主要致病因素之一[1,2]，每年因此死亡人數(shù)>100萬[3,4]。目前全球致力于輪狀病毒的消滅和提高嬰幼兒的生存率，已開發(fā)出幾種安全而有效的輪狀病毒疫苗，如葛蘭素史克公司生產(chǎn)的 Rotarix(G1P[8]型)，默克公司生產(chǎn)的Rotateq(G1-G4P[8]型)，以及我國蘭州生物制品研究所生產(chǎn)的羅特威(G10P[15]型)[5]，但Rotarix和Rotateq在一些貧窮的

2、發(fā)展中國家（如非洲、亞洲等）疫苗需求量大的地方免疫效果卻不理想;另外，這兩種輪狀病毒疫苗（單價(jià)活疫苗（Rotarix[RV1]）和五價(jià)人牛重組活疫苗（RotaTeq[RV5]））均為減毒活疫苗[6]。雖然，減毒活疫苗免疫原性更強(qiáng)，作用時(shí)間更長，但減毒活疫苗也存在一定的潛在危險(xiǎn)，如腸套疊、毒株毒力返祖[7];而羅特威僅在我國上市,是羊輪狀病毒減毒株，其G10及P[15]血清型并不是我國或者全球流行的G1，G4或者P[8]型[5]。所以研發(fā)

3、出安全高效經(jīng)濟(jì)的新型RV疫苗很有必要。本研究將經(jīng)前期篩選后的具有佐劑活性的LTB抗原表位PT8A整合到VP8*基因的C端和N端，構(gòu)建含有分子內(nèi)佐劑的RV亞單位疫苗，以獲得更安全有效的候選VP8*亞單位疫苗。
　　目的：
　　評(píng)價(jià)PT8A與VP8*融合表達(dá)后是否具有增強(qiáng)VP8*亞單位疫苗的分子內(nèi)佐劑活性。
　　方法：
　　1.PCR法擴(kuò)增得到目的基因片段PT8A-VP8和VP8-PT8A；
　　2.構(gòu)建重組質(zhì)

4、粒pET32a-PT8A-VP8和pET32a-VP8-PT8A并測序；
　　3.表達(dá)融合蛋白并純化，去除內(nèi)毒素；
　　4.免疫Balb/c小鼠；
　　5.收集小鼠血清及組織并保存；
　　6.ELISA和免疫組化等檢測相關(guān)細(xì)胞因子含量及其免疫效應(yīng)。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-PT8A-VP8和pET32a-VP8-PT8A。
　　2.融合蛋白以包涵體形式大量表達(dá)并純化。<

5、br>　　3.ELISA檢測特異性抗體。結(jié)果顯示：VP8*+LTB組和VP8-PT8A組的抗體明顯升高，與VP8*組的抗體滴度（OD值）有顯著性差異（P＜0.05），而PT8A-VP8組與VP8*組沒有顯著性差異（P＞0.05）。
　　4.VP8*+LTB組和VP8-PT8A組的抗體效價(jià)是VP8*組和PT8A-VP8組的4倍，是未免小鼠的256倍；
　　5.sIgA的檢測量：VP8*+LTB組和VP8-PT8A組的抗體明顯升

6、高，與VP8*組的OD值有顯著性差異（P＜0.01），而PT8A-VP8組與VP8*組沒有顯著性差異（P＞0.05）。
　　6.（1）TLR2僅在脾組織中表達(dá)，其平均光密度值（Mean IOD）在VP8*+LTB組高于VP8*組，且有顯著性差異（P＜0.05），與PT8A-VP8組和VP8-PT8A組無顯著性差異（P＞0.05），說明，VP8-PT8A的佐劑活性與TLR2無關(guān)，而LTB在脾（即中樞免疫器官）中的佐劑活性與TLR2相

7、關(guān)。在鼻黏膜和腸黏膜（即外周免疫器官）中，各組Mean IOD值差別不大，說明LTB在黏膜免疫組織中不經(jīng)過 TLR2發(fā)揮作用。
　?。?）JNK1/2蛋白在脾中VP8-PT8A組明顯高于其它三組，提示 VP8-PT8A的佐劑活性可能與JNK1/2的活化相關(guān)。在鼻黏膜中，雖然VP8-PT8A組明顯高于其它三組，有顯著性差異（P＜0.05）。但是，無佐劑活性的PT8A-VP8組也高于VP8*組，與LTB佐劑組相似，也有顯著性差異（P＜

8、0.05），而且，VP8-PT8A組和PT8A-VP8組的Mean IOD相當(dāng)，是LTB佐劑組的1.8倍和VP8*組的2倍，提示，在腸黏膜組織中，無論是LTB還是LTB-PT8A導(dǎo)致JNK1/2的活化，其佐劑活性均與JNK1/2的活化無直接的關(guān)系；
　?。?）MAP2K3蛋白：在脾和鼻黏膜組織中VP8-PT8A組的Mean IOD均小于其它組，且有顯著性差異（P＜0.05），而VP8*與LTB+VP8*組相當(dāng)；在腸黏膜組織中，VP

9、8-PT8A組與VP8*組相當(dāng)，且均大于PT8A-VP8組和LTB+VP8*組，并且有顯著性差異（P＜0.05），說明，MAP2K3與LTB的佐劑活性無關(guān)，PT8A(C端)的佐劑活性可能也與MAP2K3無關(guān)。但是，總體上，在脾、鼻腔和腸三種組織中，佐劑活性高的VP8-PT8A組和LTB+VP8*組的MAP2K3表達(dá)水平均低于或者略低于VP8*組，也有顯著性差異（P＜0.05），說明，MAP2K3的活化抑制了PT8A(C端)或者LTB發(fā)揮

10、免疫佐劑活性。
　　結(jié)論：
　　1.PT8A多肽融合在VP8*基因的C端后可顯著增強(qiáng)重組輪狀病毒VP8*亞單位疫苗的免疫效應(yīng)即有佐劑活性，而融合在N端無佐劑活性。
　　2.LTB的佐劑活性與TLR2通路相關(guān)，而PT8A(C端)與TLR2無關(guān)。
　　3.PT8A(C端)可能含有與LTB佐劑完全不同的分子機(jī)制。
　　4.LTB和PT8A（C端）的佐劑活性與MAP2K3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑呈負(fù)相關(guān)性。
　　5.在脾