動(dòng)脈粥樣硬化破裂斑塊模型的創(chuàng)建及骨髓干細(xì)胞動(dòng)員與移植對(duì)破裂斑塊修復(fù)的研究.pdf

1、近年來(lái)，干細(xì)胞治療心血管病已表現(xiàn)出傳統(tǒng)治療方法所無(wú)法比擬的優(yōu)越性，干細(xì)胞動(dòng)員與移植修復(fù)梗死心肌已成為治療冠心病的一個(gè)重大突破。骨髓干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，用骨髓干細(xì)胞動(dòng)員劑可促進(jìn)干細(xì)胞的增殖，增加外周血于細(xì)胞數(shù)量，可有利于損傷組織的修復(fù)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，MSCs）由于能夠自我復(fù)制，具有多向分化潛能、低免疫源性、易于分離培養(yǎng)及獨(dú)特

2、的歸巢功能，因而在臨床中具有廣泛的應(yīng)用前景。雖然近幾年采用骨髓干細(xì)胞進(jìn)行自體動(dòng)員或移植修復(fù)損傷心肌取得了一定成就，但是，目前干細(xì)胞治療ACS的研究多局限在對(duì)壞死心肌的修復(fù)，而對(duì)ACS的“始作俑者”-易損或破裂斑塊的穩(wěn)定與修復(fù)，國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。因此，研究骨髓干細(xì)胞動(dòng)員或移植穩(wěn)定與修復(fù)AS易損或破裂斑塊具有更加重大的意義。 目的: 1、本研究擬利用“液氮凍傷術(shù)”（結(jié)合高脂飲食喂養(yǎng)）創(chuàng)建一種操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、耗時(shí)短、動(dòng)物死亡

3、率低、成模滿意的與人類斑塊相似的動(dòng)脈粥樣硬化破裂斑塊模型，為破裂斑塊基礎(chǔ)研究及干預(yù)治療研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2、本研究擬在上述自創(chuàng)的兔AS破裂斑塊模型基礎(chǔ)上，利用骨髓干細(xì)胞具有分化成AS破裂斑塊修復(fù)所必需的血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和膠原纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞的潛能及獨(dú)特的“歸巢”功能，通過(guò)骨髓干細(xì)胞動(dòng)員與移植實(shí)驗(yàn)，從組織水平和蛋白水平觀察骨髓干細(xì)胞對(duì)AS破裂斑塊模型兔炎癥因子及凝血纖溶因子的影響，探索干細(xì)胞穩(wěn)定與修復(fù)破裂斑塊，追蹤干細(xì)

4、胞“歸巢”至破裂斑塊區(qū)及其分化狀況，并探索干細(xì)胞超早期移植的可能性，為臨床應(yīng)用骨髓干細(xì)胞防治急性冠脈綜合征及腦卒中提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法與結(jié)果: 第一部分： 健康純種雄性新西蘭白兔30只，隨機(jī)分為A、B組兩組：A組即液氮凍傷組（n=16），B組即對(duì)照組（n=14）。A組兔實(shí)施右頸總動(dòng)脈內(nèi)膜液氮凍傷術(shù)，術(shù)后高脂飲食喂養(yǎng)8周；B組兔單純給予高脂飲食喂養(yǎng)8周。8周末每組各抽取2只兔處死，觀察右頸總動(dòng)脈斑塊形成情況，

5、剩余兔在原實(shí)驗(yàn)血管段實(shí)施內(nèi)膜液氮激發(fā)術(shù)（方法同液氮凍傷術(shù)）以試圖激發(fā)斑塊破裂。分別于實(shí)驗(yàn)前、激發(fā)前及激發(fā)48h后采血，檢測(cè)血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、纖維蛋白原、白細(xì)胞和血小板水平，并采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)高敏C反應(yīng)蛋白（hsC-RP）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）的水平。激發(fā)48h后處死所有動(dòng)物，取出實(shí)驗(yàn)血管作HE染色、Masson三色染色和彈

6、力纖維染色，光鏡觀察斑塊及血栓形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。透射電鏡觀察斑塊的超微結(jié)構(gòu)改變及細(xì)胞的凋亡情況。應(yīng)用巨噬細(xì)胞（CD68）、T淋巴細(xì)胞（CD45RO）、平滑肌肌動(dòng)蛋白（a-SMC actin）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、p53、Ⅷ因子、基質(zhì)金屬蛋白酶2、9（MMP-2、MMP-9）的單克隆抗體對(duì)實(shí)驗(yàn)血管進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以明確斑塊處各炎性因子及凝血纖溶因子的蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果表明：（1）8周后，肉眼可見A組兔右頸總動(dòng)脈有多處黃白

7、色凸出斑塊及暗紅色血栓形成，而B組兔未見斑塊或血栓形成：光鏡及電鏡下見，A組兔右頸總動(dòng)脈內(nèi)膜顯著增厚并纖維化，平滑肌細(xì)胞變性、紊亂，內(nèi)彈力層增厚、變性，血管壁向管腔內(nèi)突出，部分斑塊中可見新生血管，呈典型的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。不穩(wěn)定斑塊則表現(xiàn)為薄纖維帽，大脂質(zhì)（或壞死）核心，大量炎癥細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等）浸潤(rùn)和膽固醇結(jié)晶，而破裂斑塊示，破裂部位多在纖維帽或肩部，圓形或圓柱形白血栓緊密地黏附在血管壁上，紅血栓則疏松地黏附在白血栓上。B

8、組兔頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞排列整齊，呈長(zhǎng)型或橢圓型，血管內(nèi)膜輕度增生，部分內(nèi)膜可見少量脂質(zhì)沉積，但無(wú)凸出斑塊形成。（2）免疫組化染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，液氮凍傷組右頸總動(dòng)脈易損或破裂斑塊處均有CD68、CD45RO、a-SMC-actin、PCNA、p53、Ⅷ因子、MMP-2和MMP-9蛋白的局部高表達(dá)。（3）造模8周后，兩組兔血清TC、LDL及TG較實(shí)驗(yàn)前均有明顯增高，組內(nèi)比較差異顯著（P<0．001），但兩組間血脂水平無(wú)統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)差異。液氮激發(fā)后，A組兔纖維蛋白原含量和血小板計(jì)數(shù)較激發(fā)前明顯增高，其激發(fā)前后差值具有顯著性差異（P<0．001）；雖然B組兔纖維蛋白原含量也較激發(fā)前明顯增高，其激發(fā)前后差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．001），但A組比B組增高更為明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0．001）。B組兔激發(fā)后血小板計(jì)數(shù)也有所增高，其激發(fā)前后差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0．05）。在剔除激發(fā)前基線的影響后，A、B兩組間激發(fā)后纖維蛋白原和血小板有明顯差異（P<0．001

10、），協(xié)變量激發(fā)前纖維蛋白原和血小板水平對(duì)反應(yīng)變量激發(fā)后纖維蛋白原和血小板水平無(wú)影響（P值分別為0．430和0．750）。A、B兩組白細(xì)胞計(jì)數(shù)與激發(fā)前相比有增高的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。A組兔激發(fā)后血清hsC-RP、MMP-9和PAI-1水平較激發(fā)前顯著性升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0．001），其激發(fā)前后差值也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．001）。B組兔激發(fā)后血清hsC-RP、MMP-9和PAI-1水平無(wú)明顯升高，其激發(fā)前后差值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在

11、剔除激發(fā)前基線水平的影響后，A、B兩組間激發(fā)后血清hsC-RP、MMP-9和PAI-1水平有明顯差異（P<0．001），協(xié)變量激發(fā)前hsC-RP、MMP-9和PAI-1水平對(duì)反應(yīng)變量激發(fā)后hsC-RP、MMP-9和PAI-1水平無(wú)影響（P值分別為0．099，0．064和0．984）。 第二部分： 28只健康純種雄性新西蘭白兔，用液氮凍傷術(shù)建立AS破裂斑塊模型。動(dòng)員組于模型建立后即刻皮下注射重組人粒細(xì)胞刺激因子（rhG-C

12、SF）30μg·kg-1·d-1，連續(xù)5d。對(duì)照組也于破裂斑塊模型建立后即刻皮下注射等量生理鹽水，連續(xù)5d。在第5天時(shí)，動(dòng)員組與對(duì)照組各隨機(jī)抽取4只兔子，每只抽取靜脈血約10mL，采用非連續(xù)密度梯度離心法分離獲取單個(gè)核細(xì)胞，用5-溴脫氧尿嘧啶（BrdU）標(biāo)記24h，然后經(jīng)靜脈注入動(dòng)物體內(nèi)，以追蹤細(xì)胞歸巢至破裂斑塊區(qū)及其分化狀況。動(dòng)員后兩組兔子均改為普通飲食喂養(yǎng)4周。兩組兔分別于動(dòng)員前及動(dòng)員第5d耳緣靜脈采血，檢測(cè)外周血有核細(xì)胞計(jì)數(shù)及單個(gè)

13、核細(xì)胞比例，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤法檢測(cè)外周血有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，血涂片法檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞比例，兩者可間接反映骨髓干細(xì)胞動(dòng)員情況；動(dòng)員后第3天及動(dòng)員4周末分別采血2ml，離心取上清液，ELISA法檢測(cè)兔血清hsC-RP、MMP-9及PAI-1水平；動(dòng)員后1周、4周末分批處死兔子取出血管，HE染色、Masson三色染色，光鏡觀察斑塊修復(fù)情況，免疫組化方法檢測(cè)CD34+、BrdU標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞及a-SMC actin、CD68、MMP-2、MMP-9和Ⅷ

14、因子的表達(dá)情況。 第三部分： 40只健康純種雄性新西蘭白兔，用液氮凍傷術(shù)建立AS破裂斑塊模型。以密度梯度離心法和貼壁篩選法相結(jié)合分離純化同種兔MSCs。模型成功建立后，將剩余實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為3組：A組即頸動(dòng)脈移植組（n=12）、B組即靜脈移植組（n=12）和C組即對(duì)照組（n=11），頸動(dòng)脈移植組在破裂斑塊建立后即刻以1ml注射器將BrdU標(biāo)記過(guò)的第5代MSCs懸液0．3ml（約1×107）移植入右頸總動(dòng)脈，孵育15min；

15、靜脈移植組則在破裂斑塊建立后即刻，以1ml注射器將BrdU標(biāo)記過(guò)的MSCs懸液0．3ml（約1×107）直接注射到兔耳緣靜脈；對(duì)照組則在破裂斑塊建立后即刻，將等量不含MSCs的IMDM培養(yǎng)液以同樣的方法植入到兔右頸總動(dòng)脈。術(shù)后常規(guī)使用抗生素預(yù)防感染，改為普通兔料喂養(yǎng)4周。分別于移植后3d和4周末空腹抽取兔靜脈血，離心取上清液，ELISA法測(cè)定血清hsC-RP、MMP-9及PAI-1水平。4周末處死兔子取出血管，HE染色及Masson三色

16、染色，光鏡觀察斑塊修復(fù)情況。應(yīng)用BrdU單克隆抗體對(duì)破裂斑塊血管進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以明確破裂斑塊處BrdU標(biāo)記的陽(yáng)性移植細(xì)胞分布情況。 結(jié)論: 1、利用“液氮凍傷術(shù)”可簡(jiǎn)單、快速、高效、廉價(jià)地創(chuàng)建動(dòng)脈粥樣硬化破裂斑塊動(dòng)物模型。該方法所建立的模型在斑塊的結(jié)構(gòu)（由一個(gè)脂質(zhì)或壞死核心和一層纖維性組織所組成）、細(xì)胞成分（平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞）、生長(zhǎng)特征（細(xì)胞增殖和膠原合成）、脂質(zhì)聚積及血栓形成等組織學(xué)特征方面與人

17、類易損或破裂斑塊相似，有望為大規(guī)模研究AS易損或破裂斑塊及血栓形成的機(jī)理和藥物干預(yù)治療提供一種新型動(dòng)物模型。 2、應(yīng)用重組人粒細(xì)胞刺激因子（rhG-CSF）自體動(dòng)員骨髓干細(xì)胞可穩(wěn)定與修復(fù)AS破裂斑塊。動(dòng)員的骨髓干細(xì)胞能“自發(fā)”地向破裂斑塊區(qū)“歸巢”，并在特定病理環(huán)境作用下向血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和膠原纖維分化，通過(guò)改善內(nèi)皮功能和血管新生，減輕斑塊內(nèi)炎性巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)而穩(wěn)定與修復(fù)AS易損或破裂斑塊。 3、應(yīng)用同種異體骨髓