應(yīng)用微陣列芯片技術(shù)分析先天性巨結(jié)腸miRNAs表達(dá)譜差異.pdf

1、先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung disease，HSCR)又稱(chēng)腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥，是一種由腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常而導(dǎo)致的大腸先天性畸形，其病理特征是腸壁肌間及黏膜下神經(jīng)叢神經(jīng)節(jié)細(xì)胞卻如。HSCR為常見(jiàn)的小兒消化道畸形之一，發(fā)病率約為1∶5000，居消化道畸形的第二位，其在亞洲人群的發(fā)病率較高。目前關(guān)于先天性巨結(jié)腸發(fā)病機(jī)制的較一致的觀點(diǎn)認(rèn)為:胚胎早期階段微環(huán)境改變及遺傳學(xué)因素在巨結(jié)腸發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，即HSCR由遺傳及環(huán)境因素共同作

2、用所致。目前，已發(fā)現(xiàn)的與先天性巨結(jié)腸發(fā)病密切相關(guān)的基因有許多種，例如RET、GDNF、NRTN、ECE1、EDN3、SOX10、PH0X2B、NRG1等。
　　近年來(lái)對(duì)HSCR的基因研究有了顯著進(jìn)步，研究者1992年第一次報(bào)道了一例10號(hào)染色體長(zhǎng)臂(10q)中間缺失的全結(jié)腸型HSCR患兒，并進(jìn)一步證實(shí)它位于10q11.2和10q21.2之間，最后研究者于1994年證實(shí)了先天性巨結(jié)腸患兒存在RET基因突變。RET原癌基因在神經(jīng)嵴細(xì)胞

3、中廣泛表達(dá)，是一種具有絡(luò)氨酸激酶活性的跨膜受體，對(duì)維持腸神經(jīng)元的發(fā)育至關(guān)重要，功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)RET基因敲除后可導(dǎo)致鼠全部消化管壁內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的缺如，因此，RET基因在先天性巨結(jié)腸的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。作為與RET基因互補(bǔ)的GDNF基因也被發(fā)現(xiàn)在HSCR患者中存在基因突變。EDNRB的表達(dá)伴隨胚胎發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，它的功能是使神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育至成熟的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中靶向破壞EDNRB基因，可以導(dǎo)致腸管出現(xiàn)無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。而與其相應(yīng)的

4、配體EDN3的基因突變也被證實(shí)在HSCR形成過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，有人報(bào)道了66例散發(fā)性及9例家族性HSCR病例的EDN3基因檢測(cè)結(jié)果，在外顯子2發(fā)現(xiàn)了一種新的雜合性突變，這種發(fā)生過(guò)早的框架移動(dòng)突變會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)區(qū)域停止編碼，其結(jié)果是產(chǎn)生無(wú)功能的基因產(chǎn)物。SOX10也被證實(shí)是HSCR的易感基因，它在胚胎期表達(dá)于神經(jīng)嵴細(xì)胞，參與外周神經(jīng)系統(tǒng)的形成，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)很多HSCR患兒存在SOX10基因突變。上述研究表明，基因在神經(jīng)嵴干細(xì)胞的分化及移行過(guò)

5、程中發(fā)揮著重要的作用，基因缺陷可明顯干擾神經(jīng)嵴細(xì)胞的移行及分化。眾所周知，腸神經(jīng)嵴細(xì)胞會(huì)快速地遷移至腸管及在腸壁內(nèi)橫向移動(dòng)，而且，腸神經(jīng)嵴細(xì)胞亞群在腸壁內(nèi)移行的過(guò)程中會(huì)進(jìn)行神經(jīng)分化，以形成神經(jīng)叢。腸神經(jīng)嵴細(xì)胞在腸道的定植是神經(jīng)細(xì)胞增殖、遷移及分化過(guò)程的完美統(tǒng)一，動(dòng)物模型中，若神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量、遷移行為或者分化比例受干擾時(shí)會(huì)發(fā)生先天性巨結(jié)腸。
　　微小RNA(MicroRNAs，miRNA)為由21～25個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼短序列單鏈

6、RNA分子，是一種內(nèi)源性小分子RNA，miRNA能夠以堿基配對(duì)的形式與其靶基因mRNA分子的3'非編碼區(qū)(3'UTR)發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而引發(fā)mRNA降解或者翻譯抑制，最終在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮基因調(diào)節(jié)作用。迄今，發(fā)現(xiàn)了上千種miRNAs，其通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)而在多個(gè)生命過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、器官發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)及各種疾病形成等。miRNA對(duì)于神經(jīng)元的發(fā)育和正常功能的維持至關(guān)重要，miRNA表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化在神經(jīng)發(fā)

7、生、成熟及大腦的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。缺失Dicer的小鼠會(huì)出現(xiàn)大腦發(fā)育缺陷—不能發(fā)育為正常的神經(jīng)元形態(tài)、神經(jīng)萎縮、嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷及早期死亡。腸神經(jīng)系統(tǒng)作為周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，其所含的神經(jīng)元在數(shù)量上與脊髓中的含量相當(dāng)，因此，miRNA可能與腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育也密切相關(guān)，而且有研究報(bào)道一些miRNAs參與腸神經(jīng)嵴細(xì)胞的分化、增殖、遷移及凋亡整個(gè)過(guò)程。而且，在發(fā)育過(guò)程中，miRNA會(huì)發(fā)揮正性和負(fù)性基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的協(xié)同作用，其

8、結(jié)果是導(dǎo)致細(xì)胞多樣性的產(chǎn)生，而一旦這種協(xié)同效應(yīng)發(fā)生障礙，就可能產(chǎn)生先天性發(fā)育異常，導(dǎo)致先天性疾病的發(fā)生。
　　第一章 應(yīng)用微陣列芯片技術(shù)篩選先天性巨結(jié)腸組織的miRNA表達(dá)譜研究
　　目的:
　　應(yīng)用miRNA微陣列芯片技術(shù)檢測(cè)先天性巨結(jié)腸狹窄段與擴(kuò)張段腸管組織差異表達(dá)的miRNAs，初步建立先天性巨結(jié)腸組織的miRNA表達(dá)譜。
　　方法:
　　收集27例在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院行手術(shù)治療的HSCR患兒的狹窄

9、段及擴(kuò)張段腸管組織，選取其中6例，使用TRIzol(Invitrogen)法提取組織總RNA，并用RNasey Mini Kit(QIAGEN)純化提取的RNA。使用NanoDrop ND-1000測(cè)量純化后的RNA濃度，電泳檢測(cè)RNA完整性。
　　結(jié)果:
　　總RNA質(zhì)量鑒定結(jié)果:A260/A280比值均接近2.0，A260/A230比值均大于1.8，表明所有組織標(biāo)本的總RNA質(zhì)量可靠，沒(méi)有降解或其它雜質(zhì)污染，如DNA、蛋

10、白質(zhì)等，可進(jìn)行后續(xù)的微陣列芯片等實(shí)驗(yàn)。miRNA微陣列芯片篩選結(jié)果表明，與擴(kuò)張段腸管組織相比，狹窄段腸管表達(dá)上調(diào)超過(guò)2倍的miRNAs有19個(gè)(miR-3941，miR-K12-1-3p，miR-K12-3-3p，miR-145-3p等)，表達(dá)下調(diào)超過(guò)2倍的有7個(gè)(miR-625-5p，miR-520g-3p，miR-1260a，miR-3916等)（P均＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　先天性巨結(jié)腸狹窄段及擴(kuò)張段腸管組織之間

11、存在顯著差異表達(dá)的miRNAs，這些顯著差異表達(dá)的miRNAs可能與先天性巨結(jié)腸的發(fā)病密切相關(guān)，為進(jìn)一步揭示HSCR的發(fā)病機(jī)制提供了新的研究思路。
　　第二章 差異表達(dá)miRNAs的靶基因預(yù)測(cè)
　　目的:
　　運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miRNAs靶基因，初步探索miRNA參與先天性巨結(jié)腸發(fā)生的機(jī)制。
　　方法:
　　依據(jù)Fold Change值、P值及ForeGround值(理想值＞100)選擇出8個(gè)較為理想

12、的miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，首先，運(yùn)用HSCR的主題詞于PubMed網(wǎng)站檢索，篩選出與HSCR發(fā)病相關(guān)的基因，然后采用Targetscan、miRTarBase、miRDB、MicroRNA.org靶基因預(yù)測(cè)軟件分析顯著差異表達(dá)的miRNAs與先天性巨結(jié)腸相關(guān)基因之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　選擇的8個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNAs靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果表明，除了miR-138-2-3p和miR-148a-3p，其余6個(gè)miRNAs與

13、HSCR相關(guān)基因存在互補(bǔ)關(guān)系。miR-193a-3p（1個(gè)靶基因）、miR-3646（5個(gè)靶基因）、miR-1260a（4個(gè)靶基因）、miR-4524b-5p（1個(gè)靶基因）、miR-145-3p（3個(gè)靶基因）、miR-4505（3個(gè)靶基因）。
　　結(jié)論:
　　6個(gè)miRNAs與HSCR相關(guān)基因存在互補(bǔ)關(guān)系，這些miRNAs可能通過(guò)這些靶基因參與先天性巨結(jié)腸的發(fā)病。
　　第三章 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證先天性巨結(jié)腸

14、組織中差異表達(dá)的miRNAs
　　目的:
　　對(duì)通過(guò)微陣列芯片實(shí)驗(yàn)獲得的且與HSCR相關(guān)基因存在互補(bǔ)關(guān)系的差異表達(dá)的miRNAs，我們應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)做進(jìn)一步的驗(yàn)證。
　　方法:
　　對(duì)收集的27例在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院行手術(shù)治療的HSCR患兒的狹窄段及擴(kuò)張段腸管組織提取總RNA后，我們作進(jìn)一步qRT-PCR驗(yàn)證。采用SYBR(R)GreenⅠ嵌合熒光法檢測(cè)miR-145-3p、miR-4505及miR

15、-1260a的表達(dá)量。miRNA引物由特異性引物及Oligo(dT)-Universal Tag通用反轉(zhuǎn)錄引物構(gòu)成。按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng):(1)2μ g含有目的miRNA的總RNA，用miRcutemiRNA First-Strand cDNA Synthesis kit試劑盒在miRNA3'末端加多聚A尾Poly(A)，再使用Oligo(dT)-Universal Tag通用反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

16、，最終合成miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一鏈，反應(yīng)條件為37℃，60min，95℃，5min，產(chǎn)物-20℃冰箱保存。(2)取2μlmiRNA第一鏈cDNA液，采用miRcute miRNA qPCR Detection kit(SYBR Green)試劑盒進(jìn)行miRNA熒光定量檢測(cè)。PCR反應(yīng)的條件為:94℃2min，1個(gè)循環(huán)，94℃20s，60℃34s，45個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，進(jìn)行歸一化。
　　結(jié)果:
　　qRT-PCR證實(shí)

17、不同組間miR-i45-3p（1.42±0.42，狹窄段vs.0.90±0.31，擴(kuò)張段）及miR-4505（1.30±0.30，狹窄段vs.0.76±0.22，擴(kuò)張段）表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.001)，且與HSCR分型有關(guān)(P=0.000)，而miR-1260a（1.11±0.25，狹窄段vs.0.99±0.21，擴(kuò)張段）的表達(dá)無(wú)明顯差異(P=0.064)。
　　結(jié)論:
　　1.miRNA芯片篩選及實(shí)時(shí)熒光定量PC