Ryanodine對(duì)Rapamycin誘導(dǎo)的EOCs功能抑制及其相關(guān)eNOS蛋白表達(dá)及活性的影響.pdf

1、目的：探討理阿諾堿(Ryanodine)對(duì)雷帕霉素(Rapamycin)誘導(dǎo)的內(nèi)皮生長(zhǎng)暈細(xì)胞(Endothelialoutgrowthcells，EOCs)功能抑制的影響及其相關(guān)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelialNitric-OxideSynthase，eNOS)蛋白表達(dá)及活性的影響。
　　 方法：采用密度梯度離心法分離30ml臍血中的單個(gè)核細(xì)胞(Mononuclearcells，MNC)，接種至事先包被有人纖維連接蛋白

2、的6孔培養(yǎng)板的一孔中(約10cm2)。加入2ml含10％胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后吸除上清及懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞加2ml上述培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后一周內(nèi)每24h換1/2原液，一周后每72h換全液并于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。待鋪路石樣細(xì)胞生長(zhǎng)匯合后傳代，擴(kuò)增后取第二代細(xì)胞采用CD34、Flk-1、Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化及DiI-ac-LDL、FITC-UEA-I雙熒光染色法鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的內(nèi)皮屬性。
　　 取第二

3、代EOC分為四組：(1)對(duì)照組：加入配制雷帕霉素和理阿諾堿的溶劑(0.3％DMSO)：(2)雷帕霉素干預(yù)組：加入10nmol/L雷帕霉素；(3)雷帕霉素和理阿諾堿共同干預(yù)組：提前1h加入10μmol/L理阿諾堿，再加入10nmol/L雷帕霉素；(4)理阿諾堿干預(yù)組：加入10μmol/L理阿諾堿，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。
　　 經(jīng)上述處理后的細(xì)胞分別采用CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力、倒

4、置顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞的粘附能力。用特異性的eNOS抗體及Phospho-eNOS（Thr495）抗體的蛋白免疫印跡法(Westernblot)檢測(cè)eNOS的蛋白表達(dá)及活性。
　　 結(jié)果：采用密度梯度離心法分離人臍血獲得的單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)約第4～6天開始出現(xiàn)梭形細(xì)胞，第7～9d形成若干個(gè)細(xì)胞集落，此后細(xì)胞集落逐漸增大至相互匯合，在倒置相差顯微鏡下可見細(xì)胞呈現(xiàn)橢圓形鋪路石樣排列，并具有極強(qiáng)的克隆增殖能力。
　　 通過激光掃描共

5、聚焦顯微鏡鑒定，第二代EOCs能夠攝取ac-LDL并結(jié)合UEA-I，雙陽(yáng)性率為100％。免疫組化染色顯示第二代EOCs的Ⅷ因子相關(guān)抗原、CD34、Flk-1表達(dá)陽(yáng)性率均為100％。
　　 EOCs與10nmol/L雷帕霉素共孵育24h后細(xì)胞的增殖能力、遷移能力、黏附能力均較對(duì)照組減弱，分別為0.64±0.04vs0.78±0.03(P＜0.05)，31.73士1.80vs54.20±1.25(P＜0.05)和2.42±0.74v

6、s7.08±1.13(P＜0.05)。10μmol/L理阿諾堿預(yù)處理1h能改善雷帕霉素對(duì)EOCs的增殖、遷移、黏附能力的抑制作用：雷帕霉素和理阿諾堿共同干預(yù)組細(xì)胞增殖、遷移、黏附能力與雷帕霉素干預(yù)組相比分別為：0.73±0.03vs0.64±0.04(P＜0.05)，41.40±1.25vs31.73±1.80(P＜0.05),4.30+1.49vs2.42士0.74(P＜0.05);10μmol/L理阿諾堿單獨(dú)作用對(duì)EOCs的增殖、遷

7、移、黏附能力、無顯著影響。理阿諾堿干預(yù)組細(xì)胞增殖、遷移、黏附能力與對(duì)照組相比分別為：0.72±0.06vs0.78±0.03(P＞0.05)，52.13±1.21vs54.20±1.25(P＞0.05),6.03±1.65vs7.08±1.13(P＞0.05)。
　　 通過Werstern-blot對(duì)各組細(xì)胞總eNOS蛋白表達(dá)及eNOS(Thr495)磷酸化水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比10nmol/L雷帕霉素對(duì)總eNOS蛋白表達(dá)

8、水平無顯著影響0.51±0.14vs0.73±0.17（P＞0.05），但增強(qiáng)eNOS(Thr495)的磷酸化水平0.76±0.09vs0.50±0.04(P＜0.05);與雷帕霉素組相比，10μmol/L理阿諾堿預(yù)處理1h對(duì)總eNOS蛋白表達(dá)無顯著影響0.52±0.14vs0.51±0.14(P＞0.05)，但降低eNOS(Thr495)的磷酸化水平，0.56±0.13vs0.76±0.09(P＜0.05);與對(duì)照組相比，10μmol

9、/L理阿諾堿單獨(dú)作用對(duì)總eNOS蛋白表達(dá)及eNOS(Thr495)磷酸化水平無顯著影響，分別為：0.52±0.16vs0.73±0.17（P＞0.05），0.51±0.11vs0.50±0.04(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：用貼壁培養(yǎng)法可以在體外成功培養(yǎng)獲得人臍血EOCs。通過熒光細(xì)胞化學(xué)染色及免疫組化染色可以證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞具有內(nèi)皮特性。
　　 雷帕霉素抑制EOCs的增殖、遷移、黏附能力、增強(qiáng)eNOS(Thr495)磷酸