氨甲?；偌t素的制備及其對(duì)過氧化氫損傷的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用的觀察.pdf

1、研究背景：促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種由腎臟分泌的，含有唾液酸的糖蛋白，以往認(rèn)為它的主要生物學(xué)作用是能夠與EPO受體(EPOreceptor，EPOR)結(jié)合后促進(jìn)紅系祖細(xì)胞分化為成熟的紅細(xì)胞從而增加循環(huán)中的紅細(xì)胞的數(shù)量，因此，EPO被廣泛應(yīng)用于治療多種原因引起的貧血，如腎性貧血、新生兒貧血、癌性貧血等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EPO及其受體還廣泛分布于各種非造血組織，例如心臟、神經(jīng)系統(tǒng)等，能夠通過抑制細(xì)胞凋亡，減

2、少炎性因子分泌及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)新生血管生長(zhǎng)等機(jī)制而發(fā)揮多種非造血作用，如神經(jīng)、心臟等的組織保護(hù)作用，所以被認(rèn)為是一種全身性的保護(hù)性細(xì)胞因子。但是促紅素本身具有促進(jìn)紅細(xì)胞增生的作用，可能會(huì)導(dǎo)致血液粘稠度增加，血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變而誘發(fā)血栓形成，因而限制了EPO的對(duì)于腦梗死等疾病的臨床應(yīng)用。然而，促紅細(xì)胞生成素的衍生物，氨甲?；偌t細(xì)胞生成素(carbamylated EPO，CEPO)與促紅細(xì)胞生成素不同，CEPO既保留了EPO的神經(jīng)組

3、織保護(hù)作用，又不刺激骨髓造血系統(tǒng)，沒有促進(jìn)紅細(xì)胞增生的作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在腎臟病變晚期的患者體內(nèi)尿素及其衍生物氰酸鹽等濃度增高后，可使EPO發(fā)生氨甲酰化反應(yīng)生成CEPO，使EPO的造血活性降低并最終加重病人貧血。隨后又有學(xué)者在體外用氰酸鉀與重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinarlt human erythropoietin，rhEPO)共同孵育后使rhEPO中的賴氨酸氨甲?；?，得到CEPO，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CEPO與EPO不同，不

4、會(huì)影響動(dòng)物的紅細(xì)胞比容，但對(duì)于腦梗死等動(dòng)物模型仍具有抑制細(xì)胞凋亡及改善動(dòng)物預(yù)后等神經(jīng)組織保護(hù)作用，且應(yīng)用于脊髓損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血、周圍神經(jīng)損傷、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎等動(dòng)物模型后發(fā)現(xiàn)CEPO均具有相似的神經(jīng)保護(hù)作用，CEPO既保留了EPO的神經(jīng)保護(hù)作用，又去除了其促進(jìn)紅細(xì)胞增生而誘發(fā)血栓形成等副作用。
　　 過氧化氫是機(jī)體代謝的產(chǎn)物，同時(shí)它也是一種活性氧，易透過細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)的金屬離子反應(yīng)形成高活性的氧自由基，導(dǎo)致一系列反

5、應(yīng)，最終引起細(xì)胞的損傷甚至死亡，現(xiàn)已成為研究缺氧等所致的細(xì)胞氧自由基損傷的重要工具。采用體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞氧自由基損傷模型，可排除整體情況下缺氧伴發(fā)的酸中毒、高碳酸血癥等諸多因素的影響，且可以與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)互補(bǔ)。
　　 SH-SY5Y細(xì)胞來源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，是一種分化程度較低的腫瘤細(xì)胞，該細(xì)胞具有明顯的軸突，其形態(tài)、生理和生化功能等與正常神經(jīng)細(xì)胞相似，最近十幾年逐漸被越來越多地應(yīng)用于神經(jīng)病學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中。
　　 研究目的

6、：利用EPO與氰酸鉀發(fā)生氨甲?；磻?yīng)而制備CEPO；觀察CEPO對(duì)過氧化氫損害的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的保護(hù)作用，并與相同劑量的EPO進(jìn)行比較，觀察CEPO對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用與EPO有無差異，并對(duì)其可能機(jī)制，如凋亡等進(jìn)行探討及研究。
　　 研究方法：
　　 一、氨甲?；偌t素的制備與鑒定
　　 1、氨甲?；偌t素的制備先將EPO干粉50000 IU(0.5mg)與適量的硼酸鈉和氰酸鉀混勻，溫育23小時(shí)后透析。用考馬斯

7、亮藍(lán)G250法測(cè)定獲得的CEPO蛋白濃度。
　　 2、氨甲?；偌t素的鑒定取100IU的EPO及上述制得的CEPO，經(jīng)二硫赤蘚糖醇與碘化乙酰胺作用后，加至經(jīng)0.05 mmol/L碳酸氫胺和0.4 mol/L尿素溶液平衡的Hi Trap625柱，進(jìn)樣后收集首柱1/3～1/2體積的洗脫液。用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定收集液體中的蛋白濃度。促紅素和上柱后的流出液各取100IU，分別加入0.4μ g Lys-c蛋白內(nèi)切酶(endoprot

8、einase Lys-C)，37℃孵育20小時(shí)，得其經(jīng)酶作用后的產(chǎn)物。將上述所有反應(yīng)物經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，加樣依次為：①M(fèi)arker蛋白；②未經(jīng)酶解的EPO50IU；③EPO經(jīng)Lys-c蛋白內(nèi)切酶酶解后的產(chǎn)物15μ L；④EPO氨甲?；蠼?jīng)Lys-c蛋白內(nèi)切酶酶解后的產(chǎn)物15μ L；⑤EPO氨甲?；笏卯a(chǎn)物50IU。電泳結(jié)束后取出分離膠，用銀染方法對(duì)蛋白進(jìn)行染色。
　　 二、CEPOX寸過氧化氫損

9、傷的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用的觀察及研究
　　 1、過氧化氫損傷模型的建立調(diào)節(jié)SH-SY5Y細(xì)胞密度后接種于6孔板，12小時(shí)后分別加入不同濃度的過氧化氫(0、50、200、300、400μ mol/L)，12小時(shí)后收集細(xì)胞，用噻唑蘭(methylthiazoletetrazolium，MTT)法測(cè)細(xì)胞存活率，根據(jù)MTT值判定實(shí)驗(yàn)所需采用的過氧化氫濃度。
　　 2、實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)選用的不同的過氧化氫濃度，將細(xì)胞分為2大組

10、進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，第1大組采用過氧化氫濃度為300μ mol幾，又分為以下幾個(gè)小組：①對(duì)照組，即過氧化氫組；②CEPO組；③EPO組；以上各組加入含300μ mol/L過氧化氫培養(yǎng)液培養(yǎng)12小時(shí)后，更換為含相應(yīng)試劑的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行下一步試驗(yàn)。第2大組為采用400μ mol幾過氧化氫，余分組同第1大組。
　　 3、細(xì)胞形態(tài)的觀察待培養(yǎng)結(jié)束后在相差倒置顯微鏡下觀察各不同分組細(xì)胞的形態(tài)，尤其是SH-SY5Y細(xì)胞的突起，胞體形態(tài)等。<

11、br>　　 4、MTT法測(cè)定細(xì)胞活性將各組SH-SY5Y細(xì)胞結(jié)束培養(yǎng)后，先后加入MTT及二甲基亞砜作用后，再于自動(dòng)免疫酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)為570nm處的吸光度。該結(jié)果可反應(yīng)細(xì)胞的存活率。
　　 5、乳酸脫氫酶的測(cè)定以損傷的SH-SY5Y細(xì)胞LDH的釋放量作為定量評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷的指標(biāo)。乳酸脫氫酶釋放量的測(cè)定方法依照乳酸脫氫酶測(cè)量試劑盒的說明書操作。細(xì)胞損傷時(shí)乳酸脫氫酶會(huì)釋放入培養(yǎng)液中，故其上清液中乳酸脫氫酶的多少可反映出細(xì)胞的損傷程度。

12、
　　 6、Annexin V/PI雙染色檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡各組細(xì)胞按不同的方法進(jìn)行培養(yǎng)，待結(jié)束培養(yǎng)后，加入凋亡試劑處理，再用PBS溶液將其洗滌并處理成單個(gè)細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。
　　 7、熒光定量RT-PCR檢測(cè)Bcl-2及細(xì)胞半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-8的表達(dá)各組細(xì)胞結(jié)束培養(yǎng)后，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。
　　

13、 研究結(jié)果：
　　 一、氨甲?；偌t素的制備與鑒定
　　 經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的結(jié)果顯示，經(jīng)Lys-C蛋白內(nèi)切酶酶切后的EPO發(fā)生了明顯降解，相對(duì)分子質(zhì)量約為3.4×104的EPO譜帶完全消失，取而代之的是相對(duì)分子質(zhì)量大約為1.4×104的蛋白譜帶，但EPO經(jīng)過氰酸鉀作用后并上柱的流出液，不論是經(jīng)Lys-C蛋白內(nèi)切酶酶切的，還是未經(jīng)酶切的，均僅為相對(duì)分子質(zhì)量約為3.4×104的單一條帶。特別是

14、經(jīng)蛋白內(nèi)切酶酶切的EPO氨甲?；蟮漠a(chǎn)物中未見到降解肽段，即未見到其它相對(duì)分子質(zhì)量小的區(qū)域有條帶，說明EPO的氨甲?；磻?yīng)十分完全，幾乎所有的EPO均轉(zhuǎn)化為CEPO。
　　 二、CEPO對(duì)過氧化氫損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用的觀察及研究
　　 1、過氧化氫對(duì)SH-SY5Y的MTT結(jié)果的影響結(jié)果顯示，隨著過氧化氫濃度的增加，MTT的值呈下降趨勢(shì)。根據(jù)該結(jié)果，我們分別選用濃度為300mol/L、400μ mol/L的

15、過氧化氫進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　 2、CEPO對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 SH-SY5Y細(xì)胞正常培養(yǎng)，不加任何處理時(shí)，細(xì)胞形態(tài)為多邊形，胞體較大，胞核飽滿，大部分細(xì)胞有突起，加用過氧化氫作用后，細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)整，胞核萎縮，細(xì)胞突起基本消失；加用不同濃度的CEPO作用后，細(xì)胞形態(tài)較單獨(dú)過氧化氫作用時(shí)規(guī)整，部分細(xì)胞可見到神經(jīng)突起恢復(fù)，且隨著CEPO的單位濃度的增加，可見到細(xì)胞突起的數(shù)量增加，胞體形態(tài)變得規(guī)整。且與EPO組相比，CEPOS對(duì)細(xì)胞

16、形態(tài)的影響與相同劑量的EPO是無明顯差別的。
　　 3、CEPO對(duì)細(xì)胞存活率的作用結(jié)果可見，對(duì)照組細(xì)胞存活率較低，而與對(duì)照組比較，CEPO、EPO組的細(xì)胞存活率明顯上升，P值小于0.01；且隨著CEPO、EPO濃度的增加，細(xì)胞存活率呈上升趨勢(shì)，但當(dāng)CEPO、EPO濃度由80IU/mL上升至100IU/mL時(shí)，細(xì)胞存活率的上升趨勢(shì)變得不明顯；相同濃度的CEPO組與EPO組相比，差異無顯著性，提示二者對(duì)細(xì)胞存活率的影響無明顯差異。<

17、br>　　 4、CEPO對(duì)細(xì)胞乳酸脫氫酶的影響細(xì)胞損傷時(shí)乳酸脫氫酶會(huì)釋放入培養(yǎng)液中，故其上清液中乳酸脫氫酶的多少可反映出細(xì)胞的損傷程度。結(jié)果顯示，過氧化氫可造成SH-SY5Y細(xì)胞損傷，使乳酸脫氫酶的值升高，而CEPO與EPO則能明顯減低乳酸脫氫酶的溢出，各組與對(duì)照組相比，P值均小于0.01；相同濃度的CEPO組與EPO組相比，差異無顯著性，P值均大于0.01，提示CEPO對(duì)乳酸脫氫酶的溢出率的影響與EPO基本相同。
　　 5、

18、CEPO對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響結(jié)果顯示，過氧化氫可造成SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，CEPO與EPO則能明顯減低細(xì)胞的凋亡率；且隨著CEPO、EPO濃度的增加，細(xì)胞凋亡率呈下降趨勢(shì)，各組與對(duì)照組相比，P值均小于0.01；但當(dāng)CEPO、EPO濃度達(dá)到100IU/mL時(shí)，細(xì)胞凋亡的下降趨勢(shì)變得不明顯，提示CEPO及EPOS對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用已達(dá)頂峰；相同濃度的CEPO組與EPO組相比，差異無顯著性，說明CEPO對(duì)細(xì)胞凋亡率的抑制與EPO的的基本相同

19、。
　　 6、CEPO對(duì)細(xì)胞Bcl-2及Caspase-8的mRNA表達(dá)的影響結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EPO與CEPO組的Bcl-2 mRNA的表達(dá)是增高的，而Caspase-8 mRNA的表達(dá)是降低的，各組與對(duì)照組相比，P值均小于0.01；且隨著CEPO、EPO濃度的增加，這種變化趨勢(shì)更加明顯，但當(dāng)CEPO、EPO濃度由80IU/mL達(dá)到100IU/mL時(shí)，這種變化趨勢(shì)變得不明顯，說明CEPO及EPO對(duì)Bcl-2及Caspas

20、e-8的mRNA表達(dá)的影響已達(dá)到頂峰；相同濃度的CEPO組與EPO組相比，差異無顯著性。
　　 結(jié)論：
　　 1、利用EPO與氰酸鉀共同孵育的方法制備出氨甲酰基促紅素并利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，EPO經(jīng)Lys-C蛋白內(nèi)切酶酶切后全部降解，而EPO經(jīng)氨甲?；髣t沒有發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶切后降解的產(chǎn)物，表明CEPO不僅制備成功，且所獲得的CEPO具有極高的純度。
　　 2、經(jīng)過氧化氫作用后，SH-SY5Y

21、細(xì)胞損傷明顯，當(dāng)經(jīng)不同濃度的CEPO和EPO作用后，細(xì)胞的存活率隨著CEPO及EPO濃度的增加而上升，乳酸脫氫酶的值隨著CEPO及EPO濃度的增加而下降，證明CEPO及EPO對(duì)氧自由基損傷的SH-SY5Y細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，這種對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用是隨著濃度的增加而增強(qiáng)的。同時(shí)，對(duì)于本實(shí)驗(yàn)中所采用的不同濃度的過氧化氫，CEPO及EPO均起到了一定程度的保護(hù)作用，提示即使對(duì)于氧自由基損傷程度較重的SH-SY5Y細(xì)胞，CEPO仍具有明顯的保

22、護(hù)作用，且CEPO對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用與EPO是基本相同的。
　　 3、經(jīng)流式細(xì)胞儀對(duì)Annexin V/PI進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過CEPO及EPO的作用后，細(xì)胞的凋亡率降低，且隨著CEPO及EPO濃度的增加凋亡率降低得更加明顯，提示對(duì)凋亡的抑制參與了該保護(hù)作用。400μ mol/L濃度的過氧化氫組的凋亡率下降的程度與300μ mol/L濃度組基本相同，提示即使是對(duì)于氧自由基損傷程度較重的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，不同濃

23、度的CEPO也發(fā)揮了其較好的抗凋亡作用。CEPO組與EPO組相比，無明顯的差異，提示CEPO與EPO的抗凋亡作用是基本相同的。
　　 4、采用熒光定量RT-PCR技術(shù)對(duì)Bcl-2及caspase-8進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過CEPO及EPO的作用后，caspase-8均較對(duì)照組降低，而Bcl-2則升高，隨著CEPO及EPO濃度的增加而變化得更加明顯，但在濃度從80IU/mL上升至100IU/mL時(shí)，變化程度則變得不明顯，提示C

24、EPO的抗凋亡作用可通過Bcl-2基因的調(diào)控及對(duì)caspase-8進(jìn)行抑制作用而實(shí)現(xiàn)。400μ mol/L濃度的過氧化氫組的凋亡率下降的程度與300μ mol幾濃度基本相同，提示即使是對(duì)于損傷程度較重的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，CEPO也發(fā)揮了其較好的抗凋亡作用。CEPO組與EPO組相比，無明顯的差異，提示CEPO對(duì)Bcl-2及caspase-8的調(diào)節(jié)作用與EPO是基本相同的。
　　 意義：本研究首次對(duì)氨甲?；偌t素對(duì)氧自由基損傷的神經(jīng)