依達拉奉對過氧化氫損傷的人臍帶源間充質(zhì)干細胞的保護作用.pdf

1、背景和目的：
　　依達拉奉（EDAEdaravone）分子量小且脂溶性高，是一種效果較強的自由基清除劑，因此比較容易到達作用部位而發(fā)揮療效，臨床上主要用于腦缺血、腦梗死的治療。近年來，動物實驗及多組臨床觀察證實依達拉奉對心血管系統(tǒng)也有較好的保護作用，能改善多種心血管疾病的預(yù)后。干細胞是不斷更新且具有較強分化能力的細胞，可分成兩種：成體干細胞以及胚胎干細胞。人臍帶源間充質(zhì)干細胞（Human umbilical cord-derive

2、d mesenchymal stem cells hUC-MSCs)，可分化為骨、脂肪、神經(jīng)等多種類型的細胞。并具有材料來源方便、無傷害，增殖迅速，低免疫原性的優(yōu)點，經(jīng)常被作為理想種子細胞用于治療心血管疾病，并取得良好效果。但由于炎細胞侵潤、缺血所導(dǎo)致的缺氧等因素的影響,在心肌損傷區(qū)會生成許多活性氧（reactive oxygen species ROS），引起氧化應(yīng)激狀態(tài)的發(fā)生，損害相應(yīng)細胞的活性，導(dǎo)致移植效果不佳。過氧化氫（hydr

3、ogen peroxide H2O2）是常見的活性氧，其在體內(nèi)可通過多種方式損害體內(nèi)的細胞。本研究即探討EDA對H2O2損傷的臍帶源干細胞的有效保護作用。
　　方法：
　　1、損傷hUC-MSCs合適的H2O2濃度及時間的確立分離所得相應(yīng)的hUC-MSCs后，在體外進行培養(yǎng)、繁殖、凍存、蘇醒以及鑒定并制作相應(yīng)的生長曲線；選取對數(shù)期的細胞用50、100、200、400、600、800、1000 mmo1/L H2O2處理1h、

4、4h、8h，確定實驗室條件下?lián)p傷hUC-MSCs合適的H2O2濃度及損傷時間。
　　2、EDA對于H2O2損傷的臍帶源干細胞保護作用的研究應(yīng)用確定濃度的H2O2損傷hUC-MSCs確定相應(yīng)的時間，應(yīng)用10、40、80umol/L的EDA溶液培養(yǎng)經(jīng)H2O2損傷的hUC-MSCs1小時、4小時、8小時，然后對培養(yǎng)所得的細胞的形態(tài)進行觀察，測定其相應(yīng)的代謝率，并使用血細胞計數(shù)板對相應(yīng)細胞進行計數(shù)。
　　結(jié)果
　　1、損傷hU

5、C-MSCs合適的H2O2濃度及時間的確立從足月剖腹產(chǎn)健康胎兒臍帶中分離出hUC-MSCs后，經(jīng)體外培養(yǎng)、擴增純化、凍存復(fù)蘇，傳代所得的細胞表現(xiàn)為成纖維細胞樣長梭形且形態(tài)較為單一，漩渦生長或平整排列生長，凍存再次蘇醒后細胞的活性基本無變化,使用流式細胞儀檢測培養(yǎng)的hUC-MSCs大量表達CD90、CD105，不表達CD34、CD45。生長曲線表明：hUC-MSCs在培養(yǎng)的3-6天進入對數(shù)生長期；MTT法測定細胞的代謝率表明H2O2對hU

6、C-MSCs的損傷具有濃度與時間依賴性；MTT法測定相應(yīng)細胞的代謝率，使用顯微鏡觀察細胞形態(tài)，通過血細胞計數(shù)板進行相關(guān)細胞計數(shù)所得：均顯示600mmo1/L H2O2處理4h引起的hUC-MSCs的損傷處于適當水平。損傷1小時時，每個H2O2濃度損傷組和正常的對照組相關(guān)細胞的MTT（OD）值差別均不存在統(tǒng)計學意義，細胞形態(tài)也無明顯變化；在H2O2處理4h時，50、100以及200mmol/L的H2O2損傷組和其對應(yīng)的對照組細胞的MTT（

7、OD）差別不存在統(tǒng)計學意義，400、600、800、1000mmol/LH2O2損傷組和其對應(yīng)的對照組之間均存在差別，并且隨著濃度的增大，MTT（OD）值呈逐漸下降趨勢；50、100、200以及400mmol/L的H2O2損傷組細胞形態(tài)與相關(guān)對照組不存在明顯的差別，600mmol/L的H2O2損傷組細胞與對照組相比發(fā)生變形，胞體變小，細胞間隙增寬，胞核模糊，但細胞邊界尚清楚， 細胞數(shù)量明顯減低；在800以及1000mmol/L

8、的H2O2損傷組相關(guān)細胞變形明顯，失去典型的長梭形，排列稀疏無法呈流水線生長，細胞邊界不清楚，有較多細胞脫落，細胞數(shù)量明顯減少；損傷8h時，每個濃度損傷組MTT（OD）值和對照組差別有意義，且隨濃度增大，MTT（OD）值呈逐漸下降趨勢；各濃度H2O2損傷組相關(guān)細胞變形明顯，失去典型的長梭形，排列稀疏無法呈流水線生長,細胞邊界不清楚，有較多細胞脫落，細胞數(shù)量明顯減少。
　　2、EDA對H2O2損傷的臍帶源干細胞保護作用的研究600m

9、mol/L的H2O2損傷hUC-MSCs4h后，應(yīng)用濃度不同的EDA溶液進行培養(yǎng)1h、4h及8h，結(jié)果顯示：培養(yǎng)1h時，各EDA濃度組相關(guān)細胞的形態(tài)、MTT值及數(shù)量與H2O2損傷組差別無統(tǒng)計學意義；培養(yǎng)4h時，10、20umol/L的EDA組和H2O2損傷組細胞的MTT（OD）值、細胞數(shù)量的差別不存在統(tǒng)計學意義，細胞形態(tài)無明顯區(qū)別；40、80umol/L的EDA培養(yǎng)組與H2O2損傷組相比MTT（OD）值、細胞數(shù)量均有明顯提升，且存在統(tǒng)計

10、學意義；各濃度依達拉奉組之間MTT（OD）值、細胞數(shù)量隨依達拉奉濃度升高而升高，且差別有統(tǒng)計學意義，隨依達拉奉濃度升高，細胞形態(tài)較前正常，邊界清楚、平滑；培養(yǎng)8h時，10、20、40以及80umol/L的EDA培養(yǎng)組和H2O2損傷組比較MTT（OD）值、相關(guān)細胞數(shù)均有明顯提升，且有統(tǒng)計學意義；各濃度依達拉奉組之間MTT（OD）值、細胞數(shù)量隨依達拉奉濃度升高而升高，且差別有統(tǒng)計學意義，隨依達拉奉濃度升高，細胞形態(tài)接近于正常，邊界清楚、平滑