利用褐菖鲉肝MT和HSPs的LAMP技術監(jiān)測海洋重金屬污染.pdf

1、目前我國對海洋環(huán)境中重金屬污染的監(jiān)測仍然是以化學分析為主，化學分析方法雖然能對環(huán)境或生物體內重金屬含量進行精確的定量，但無法反映污染物的生物效應，也難以了解污染物對海洋生態(tài)系統(tǒng)造成的破壞程度，很難評估其潛在毒性。因此篩選出與環(huán)境污染物相關性好的分子生物標志物，并建立特異性強、微量鑒定、費用低廉的快速檢測方法具有良好的應用前景和效益。
　　 本研究以靈敏度高、特異性強的海洋重金屬污染生物標志物—MT為指標，克隆了褐菖鲉(Sebas

2、tiscus marmoratus)的MT基因序列，建立并優(yōu)化了針對MT的LAMP技術。為驗證該方法的可行性，將褐菖鲉分別曝露于1.6μg·L-1、8.0μg·L-1、40μg·L-1、200μg·L-1、500μg·L-1的Cd和Pb7d后，利用LAMP技術和Realtime-PCR技術定量測定肝臟MT mRNA表達量，對比驗證兩者結果。同時利用LAMP技術對污染后HSPs(HSP60、HSC70、HSP70、HSP90)基因的表達量

3、進行檢測，分析Cd和Pb與HSPs各亞型的劑量-效應關系，篩選出重金屬污染的早期預測指標。主要研究結果如下:
　　 (1)建立并優(yōu)化了褐菖鲉MT的LAMP檢測技術，結果表明，外引物與內引物濃度比為1∶6時擴增效果最好，最佳Mg2+濃度為6 mmol·L-1，甜菜堿最佳濃度為0.4 mol·L-1，最佳dNTP濃度為1.4 mmol·L-1，最適反應溫度為64℃，最佳反應時間為60 min。
　　 (2) Cd、Pb污染實

4、驗表明，利用LAMP技術定量測定褐菖鲉肝臟MT表達量與Real-time PCR檢測結果有高度的一致性，證實了LAMP技術應用于重金屬污染樣品檢測的可行性。且LAMP技術具有反應速度快、設備簡單、結果易于鑒定等Real-time PCR無法比擬的優(yōu)勢，更適合作為海洋重金屬污染的現場監(jiān)測方法。
　　 (3)褐菖鲉肝臟MT對不同濃度Cd和Pb污染的響應趨勢大不相同。MT對Cd污染較敏感，在8.0μg·L-1濃度組被強烈誘導且mRNA

5、表達量達到最大值，為對照組的12.27倍，其余各濃度組與對照組無顯著性差異，表明MT可以作為Cd污染早期預測指標。MT對Pb污染較不敏感，40μg·L-1濃度組之前隨濃度的增加mRNA表達量逐漸下降，而后逐漸上升，在500μg·L-1組達到最大值，但所有濃度組與對照組均無顯著性差異。
　　 (4)采取LAMP技術檢測Cd與Pb污染后HSPs的表達量表明，HSPs對單一重金屬的不同濃度以及不同重金屬的響應趨勢各異，總體對Cd比Pb

6、敏感。對Cd污染早期就比較敏感的基因有HSC70和HSP70，較低濃度組誘導下HSC70和HSP70的表達量均上升，HSP70上升顯著，為對照組的54.07倍;HSP60和HSP90在低濃度誘導下上升不顯著或被抑制，在污染高濃度組表達量上升，分別在8.0μg·L-1和40μg·L-1達到最大值。對Pb污染早期比較敏感的基因為HSC70和HSP90，在1.6μg·L-1濃度組，這兩種基因的表達量均被誘導，HSP90上升顯著(P=0.003