幽門螺桿菌八聚異戊二烯焦磷酸合成酶和精氨酸酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、幽門螺桿菌（H. Pylori）為革蘭陰性微需氧菌，主要定植于感染患者的胃部，是慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍的重要致病因素，與胃癌、胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)，世界衛(wèi)生組織已將其列為一類致癌因子。H. Pylori 感染率極高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界人群感染率超過(guò)50％，我國(guó)感染人群超過(guò)6億人，在某些地局部區(qū)感染率甚至達(dá)到90％以上。雖然H. Pylori 發(fā)現(xiàn)至現(xiàn)在已有超過(guò)27年的歷史，對(duì)其病原病因?qū)W、流行病學(xué)、致病機(jī)制、毒力因子、診斷

2、治療預(yù)防方法等也進(jìn)行了非常深入的研究，但仍然有很多問(wèn)題仍不是很清楚，如H. Pylori 感染的持續(xù)性和慢性化機(jī)制，H. Pylori 感染與胃癌之間的關(guān)系，H. Pylori 感染率高但發(fā)病率低的原因等等。深入闡明其致病機(jī)制，對(duì)有針對(duì)性地開發(fā)治療的創(chuàng)新藥物、設(shè)計(jì)治療方案、研制有效的疫苗、制定預(yù)防控制措施具有重要的理論指導(dǎo)意義。
　　 H. Pylori能夠成功定植于宿主胃部特殊的生理環(huán)境中，粘附胃上皮細(xì)胞進(jìn)而引起多種胃部疾病，

3、與其所具有的種類和數(shù)量眾多的致病因子密切相關(guān)，如與H. Pylori 毒力直接相關(guān)的致病因子CagA、VacA、Urease、Hsp60、NAP、OipA、DupA等；與粘附和定植相關(guān)的BabA、SabA、SabB、AlpA、AlpB、IceA、HpaA 以及最近幾年發(fā)現(xiàn)的新的粘附分子HP1188和HP1430等；與耐酸相關(guān)的有碳酸酐酶、雙組份系統(tǒng)蛋白CrdS/CrdR、ArsR/ArsS等。這些蛋白都與H. Pylori的感染和致病有

4、著密切的關(guān)系。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮功能的基礎(chǔ)，致病因子發(fā)揮作用與其獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)?；诖耍狙芯繑M采用結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法，解析與H. Pylori 致病和重要生理功能密切相關(guān)的一些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，通過(guò)結(jié)構(gòu)明確其發(fā)揮功能和致病的分子機(jī)制，為H.Pylori 感染和致病機(jī)制研究提供理論指導(dǎo)。本研究共篩選了包括毒力因子、粘附分子、耐酸相關(guān)蛋白以及參與重要生理功能的酶類等20個(gè)以上的靶標(biāo)，目前成功解析了其中兩個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，另有三個(gè)蛋白結(jié)晶

5、，部分工作仍在進(jìn)行中。
　　 本論文是對(duì)所獲得的一些主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果的總結(jié)，包括以下幾個(gè)方面的內(nèi)容。
　　 第一部分為幽門螺桿菌(H. Pylori)八聚異戊二烯焦磷酸合成酶(OPPs)的結(jié)構(gòu)解析及酶學(xué)機(jī)理研究。OPPs催化5個(gè)異戊二烯焦磷酸(IPP)與法尼酯焦磷酸(FPP)發(fā)生連續(xù)的縮合反應(yīng)，生成40C的八聚異戊二烯焦磷酸(OPP)，OPP組成CoQ的側(cè)鏈,后者在呼吸鏈的電子傳遞中發(fā)揮了重要作用，敲除該基因后細(xì)菌的生長(zhǎng)明顯

6、受到抑制，提示其功能的重要性。本研究克隆、表達(dá)并純化了來(lái)源于H. Pylori的OPPs蛋白，采用該蛋白生長(zhǎng)晶體并收集了2.0?的高質(zhì)量衍射數(shù)據(jù)，采用MAD法解析了OPPs的結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)結(jié)構(gòu)的分析，明確了該蛋白的單體結(jié)構(gòu)和二體組裝方式、酶活中心的構(gòu)象以及參與反應(yīng)的關(guān)鍵殘基等信息，同時(shí)分析了該結(jié)構(gòu)與同源結(jié)構(gòu)之間的差異，提出了該家族酶類的底物招募和產(chǎn)物釋放機(jī)制，并確定了參與反應(yīng)終止即控制產(chǎn)物長(zhǎng)度的關(guān)鍵殘基。通過(guò)分子對(duì)接和建模技術(shù)獲得了底物I

7、PP、FPP、中間產(chǎn)物GGPP與OPPs的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上提出了trans-異戊二烯家族酶類的可能的催化模型，對(duì)該家族酶類的反應(yīng)機(jī)制有了更加深入的認(rèn)識(shí)。
　　 第二部分為H. Pylori精氨酸酶RocF的結(jié)構(gòu)解析及酶活測(cè)定體系的建立。精氨酸酶是尿素循環(huán)中的一個(gè)關(guān)鍵酶，水解精氨酸生成尿素和鳥氨酸,需要在二價(jià)金屬離子存在的條件下才能發(fā)揮活性，它是H. Pylori耐酸體系的重要組成部分，在H. Pylori的適應(yīng)性定植中發(fā)揮

8、了重要作用。此外，它還通過(guò)減少宿主巨噬細(xì)胞生成NO和抑制T細(xì)胞增生降低宿主的免疫應(yīng)答，在H. Pylori的免疫逃逸和持續(xù)性感染中發(fā)揮了重要作用。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲除RocF編碼基因后，H. Pylori的定植數(shù)量明顯下降，而這正是通過(guò)宿主NO合成增加造成的，提示RocF在抗機(jī)體天然免疫以及在H. Pylori的感染和致病中的重要性。與其他的精氨酸酶相比，RocF有許多不同之處，如在酸性和結(jié)合Co2+的條件下活性最強(qiáng)，還原劑對(duì)其活性影響

9、很大，序列中間有一個(gè)13個(gè)殘基的插入，N端C端也有明顯不同等,提示其結(jié)構(gòu)可能與其他精氨酸酶存在差異。基于此，本研究對(duì)RocF進(jìn)行了克隆表達(dá)和純化，生長(zhǎng)晶體并采用分子置換法成功解析了其結(jié)構(gòu)，明確了參與離子結(jié)合的關(guān)鍵殘基以及活性中心的位置，并分析了RocF與其他精氨酸酶序列與折疊方式上的差異。同時(shí)建立了酶活測(cè)定體系，明確了還原劑對(duì)酶活的抑制作用以及RocF對(duì)離子的選擇性(Co2+>Ni2+>Mn2+)。目前我們正嘗試通過(guò)獲得RocF與抑制劑

10、nor-NOHA和BEC的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，并結(jié)合點(diǎn)突變等實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)RocF的催化機(jī)理進(jìn)行深入的探討。
　　 第三部分為博士期間的其他工作，包括，1)H. Pylori粘附素HpaA的初步晶體學(xué)研究，病原體的粘附和定植是發(fā)生感染和致病的前提，HpaA是H. Pylori最為重要的粘附分子，在H. Pylori與胃上皮細(xì)胞的粘附中發(fā)揮了重要作用，同時(shí)它還具有很強(qiáng)的免疫原性，是一種重要的保護(hù)性抗原，廣泛用于疫苗的研發(fā)。本研究成功實(shí)現(xiàn)了該蛋

11、白的可溶性表達(dá)，經(jīng)純化得到高純度的蛋白，通過(guò)大規(guī)模的搜索獲得了晶體，但晶體質(zhì)量不是很好，衍射能力較弱，目前正在對(duì)晶體進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。2)熱休克蛋白HspA、毒力因子CagA、耐酸相關(guān)蛋白ArsS的初步晶體學(xué)研究，HspA是一種分子伴侶蛋白，參與其他蛋白的折疊，比同源蛋白多了一段特殊的C端結(jié)構(gòu)域，并且在結(jié)合Ni2+和Bi3+時(shí)呈現(xiàn)出不同的寡聚方式。CagA是H. Pylori最為重要的毒力因子，通過(guò)Ⅳ型分泌系統(tǒng)分泌至宿主細(xì)胞，通過(guò)與某些

12、蛋白相互作用發(fā)生磷酸化，進(jìn)而通過(guò)一些信號(hào)通路引起胃上皮細(xì)胞極性的改變、緊密連接的破壞、肌動(dòng)蛋白的交聯(lián)和拉伸以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能的改變，從而引起相關(guān)疾病，并且和胃癌的發(fā)生有一定的關(guān)系。而ArsR是雙組份系統(tǒng)的蛋白，可以感受菌體環(huán)境的變化從而調(diào)控一些耐酸相關(guān)蛋白的表達(dá)，與H. Pylori耐酸和適應(yīng)性定植密切相關(guān)。前期工作中，對(duì)上述完整蛋白或篩選的肽段進(jìn)行了克隆表達(dá)和純化，經(jīng)純化得到了高濃度的蛋白并對(duì)蛋白的性質(zhì)進(jìn)行了分析，但通過(guò)多輪的結(jié)晶條件的