中藥安替可膠囊的物效基礎及配伍機制研究.pdf

1、背景:
　　由于環(huán)境的污染，人們生活方式的改變，惡性腫瘤已成為威脅人類生命和健康的一大殺手。近年來，關于抗腫瘤治療的研究一直在不斷發(fā)展和進步，但依舊沒有取得突破性進展，攻克惡性腫瘤仍然是人類面臨的一大科學難題。中醫(yī)中藥治療腫瘤因其整體性、多靶點、高效低毒的特征有著良好的效果，因此從祖國傳統(tǒng)醫(yī)學中發(fā)掘具有顯著抗腫瘤作用的中藥及中藥復方，已成為國內外抗腫瘤領域研究的一個重要思路。安替可膠囊由蟾皮和當歸二味中藥材配伍組成，大量實踐表明，

2、其對惡性腫瘤的臨床治療具有明顯的療效。然而，安替可膠囊與其它中藥復方一樣，存在著功效成分不清楚、作用機制不明確的缺陷，制約著安替可膠囊的廣泛應用以及在國際上的認可。因此，對安替可膠囊進行全面系統(tǒng)的成分分析，闡明安替可膠囊發(fā)揮抗腫瘤作用的藥效物質基礎、作用機制和組方原理，進而從中篩選出成分清楚、靶點確切、配伍合理、療效顯著的化學成分組方，不僅對于其二次開發(fā)有著重要的意義，更是實現中藥現代化、國際化的迫切需要。本研究基于此目的，采用中藥指紋

3、圖譜、血清藥物化學和藥代動力學等研究手段，檢測安替可膠囊中主要化學成分及其入血移行成分、安替可膠囊及其主成分抗腫瘤活性等，藉此闡明安替可膠囊組方的科學性和合理性。
　　方法:
　　1.安替可膠囊的成分分析和質量控制：利用高效液相色譜法建立安替可膠囊的指紋圖譜和多成分含量測定的分析方法，在此基礎上，對色譜圖中安替可膠囊的特征色譜峰進行篩選，并結合已知對照品對特征色譜峰進行化學鑒定和含量測定。色譜條件：Angilent Zorb

4、ax SB-C18色譜柱（4.6×250mm，5μm），Angilent Zorbax SB-C184.6×12.5mm保護住，柱溫：30℃；流動相采用乙腈（A）和0.1％冰醋酸-0.5%磷酸二氫鉀水溶液（磷酸調節(jié)pH＝2.4）（B）梯度洗脫的方法，時間程序為：8%乙腈（0min），30%乙腈（20min），40%乙腈（45min），50%乙腈（70min），40%乙腈（75min），和8%乙腈（80min），流速0.8mL/min；進

5、樣量：20μL，檢測波長：296nm。
　　2.安替可膠囊血中移行成分分析：利用甲醇加熱回流提取后濃縮，真空冷凍干燥器揮干其中水分的方法，制備安替可膠囊、蟾皮藥材和當歸藥材提取物的凍干粉；采用血清藥物化學的研究手段和安替可膠囊指紋圖譜的色譜條件，分析安替可膠囊凍干粉經灌胃給藥后大鼠血清的高效液相色譜圖，并與安替可膠囊凍干粉指紋圖譜、已知對照品色譜圖、空白血清色譜圖相比較，鑒定安替可膠囊凍干粉的入血成分。
　　3.蟾皮、當歸及

6、其配伍在大鼠體內的藥代動力學研究：利用高效液相色譜技術，建立同時測定大鼠血漿中阿魏酸、洋川芎內酯I、遠華蟾毒精和蟾毒靈4種成分血藥濃度的分析方法，色譜條件為Angilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6×250 mm，5μm）， Angilent Zorbax SB-C184.6×12.5mm保護住，流動相采用乙腈（A）和0.1%冰醋酸-0.5%磷酸二氫鉀水溶液（磷酸調節(jié)pH＝2.4）（B）梯度洗脫的方法，時間程序為：10%

7、乙腈（0min），20%乙腈（6min），40%乙腈（40min），50%乙腈（50min），30%乙腈（55 min），和10%乙腈（60 min），流速0.8 mL/min，柱溫：30℃，進樣量：20μL，檢測波長：296 nm；由此分別繪制了4種成分分別在蟾皮單味、當歸單味和蟾皮當歸配伍給藥條件下的血藥濃度-時間曲線，比較三組之間4種血中移行成分的藥代動力學參數的差異，探討藥物配伍使用后對主要活性成分藥代動力學規(guī)律的影響。

8、　　4.蟾毒靈配伍阿魏酸體外抗腫瘤的實驗研究：利用MTT法，分析蟾毒靈和阿魏酸對人源性肝癌細胞株HepG2、HCCLM3、Hep-3B、Bel-7404和QGY-7703的細胞毒作用并分別計算半數抑制濃度（IC50）；以Chou-Talalay聯合指數法分析蟾毒靈和阿魏酸配伍應用對五種肝癌細胞株的藥物聯合作用指數（CI）；利用流式細胞技術分析蟾毒靈、阿魏酸及其配伍使用，對肝癌細胞株HepG2細胞周期分布的影響。
　　結果:

9、　　1.安替可膠囊的成分分析和質量控制：色譜圖中篩選出28個共有色譜峰為安替可膠囊的特征色譜峰，其中16個色譜峰經過鑒定分別對應：阿魏酸、日蟾毒它靈、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙?；付舅`、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、阿魏酸松柏酯、華蟾酥毒基、洋川芎內酯 A、脂蟾毒配基、蒿本內酯和正丁烯基苯酞。建立了同時測定安替可膠囊中16種成分含量的方法，該方法穩(wěn)定可行、精密度高、重復性好，各成分回收率在94.86～10

10、3.10%范圍內，適用于安替可膠囊的質量控制。
　　2.安替可膠囊血中移行成分分析：大鼠灌胃給予安替可膠囊凍干粉后，從血清中鑒定出9個移行成分，并確證了其中4個成分的化學結構，分別歸屬于當歸的阿魏酸、洋川芎內酯I和蟾皮的遠華蟾毒精、蟾毒靈；由此推測阿魏酸、洋川芎內酯I、遠華蟾毒精和蟾毒靈4種成分可能為安替可膠囊發(fā)揮抗腫瘤藥效的主要活性成分。
　　3.蟾皮、當歸及其配伍在大鼠體內的藥代動力學研究：蟾皮配伍當歸給藥與當歸單味給藥

11、兩組相比，阿魏酸和洋川芎內酯I的藥物達峰濃度，藥時曲線下面積明顯提高（P﹤0.05），平均滯留時間，血漿清除率，表觀分布容積顯著降低（P﹤0.05）；蟾皮配伍當歸給藥與蟾皮單味給藥組相比，遠華蟾毒精和蟾毒靈的藥物達峰濃度，藥時曲線下面積明顯減?。≒﹤0.05），而平均滯留時間，血漿清除率，表觀分布容積顯著升高（P﹤0.05）；提示蟾皮和當歸配伍給藥能夠有效促進阿魏酸和洋川芎內酯I在大鼠血中的吸收，降低藥物血漿清除率，提高生物利用度，同時

12、能夠有效延長遠華蟾毒精和蟾毒靈的作用時間并促進藥物向組織分布。
　　4.蟾毒靈配伍阿魏酸體外抗腫瘤的實驗研究：MTT結果顯示，蟾毒靈細胞毒性顯著并呈明顯的量-效依賴關系，對五種肝癌細胞株的半數抑制濃度分別為57.60、83.13、74.16、27.47、52.31μM；阿魏酸細胞毒性較弱，其對五種肝癌細胞株的半數抑制濃度分別為1.98、1.89、3.20、0.97、1.16mM；Chou-Talalay法分析結果發(fā)現，蟾毒靈和阿魏

13、酸配伍作用于五種肝癌細胞株，在大多數合用情況下聯合用藥指數CI大于1.0，兩藥聯用時互相拮抗；流式細胞技術分析結果顯示，蟾毒靈單用能夠將HepG2細胞阻滯于G2/M期（P﹤0.05），阿魏酸對HepG2細胞分裂G1/G0期和S期無明顯影響，兩藥配伍使用，其G2/M期阻滯作用比蟾毒靈單用更強（P﹤0.05）。
　　結論:
　　首次建立安替可膠囊HPLC指紋圖譜，確證其中28個共有色譜峰并歸屬其中16種成分；利用血清藥物化學方法