Toll樣受體2和4在大鼠心肌缺血-再灌注損傷模型中的運態(tài)表達(dá).pdf

1、目的:心肌缺血/再灌注損傷(myocardialischemic/reperfusioninjury，MI/RI)是指心肌組織缺血一段時間，當(dāng)血流重新恢復(fù)后，組織的損傷程度不僅沒有減輕反而較缺血時進(jìn)一步加重、器官功能進(jìn)一步惡化的綜合征。局部和全身的炎癥反應(yīng)為心肌缺血/再灌注損傷的特征，進(jìn)一步可能發(fā)展為組織損傷并嚴(yán)重影響左心室功能。越來越多的實驗研究證明心肌缺血/再灌注是一組慢性炎癥疾病。近年來發(fā)現(xiàn)Toll樣受體在炎癥反應(yīng)中的作用越來越重

2、要，與缺血/再灌注損傷的關(guān)系越來越緊密。本實驗旨在通過觀察大鼠心肌組織缺血/再灌注急性期Toll樣受體2(Toll-likereceptor2，TLR2)和4(Toll-likereceptor4，TLR4)及相關(guān)炎性因子mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，探討TLR2和TLR4的相互關(guān)系及各自在心肌缺血/再灌注損傷中的作用。
　　 方法:選擇體重相似的雄性Wistar大鼠42只，根據(jù)再灌注時間不同分為7組（再灌注1、2、4、6、12、24

3、h和7d組），每組6只。用戊巴比妥鈉麻醉大鼠后固定于鼠臺，在呼吸機輔助呼吸的前提下，開胸擠出心臟，結(jié)扎前降支主干，建立大鼠心肌缺血模型，缺血1h后，再次開胸，在胸腔內(nèi)用顯微外科剪剪開結(jié)扎線，建立再灌注模型，再灌注達(dá)到預(yù)期時間后，再次麻醉大鼠，固定于鼠臺上，分離頸部皮膚及皮下組織，露出氣管并進(jìn)行氣管插管，然后分離出右側(cè)頸總動脈并插管備用。開胸分離出心臟，原位結(jié)扎前降支。從頸總動脈注入約1～1.5mL酞菁藍(lán)溶液，可見到心臟部分變藍(lán)，立即剪下

4、心臟，用冰鹽水沖洗干凈后放于干凈培養(yǎng)皿內(nèi)，置于冰箱內(nèi)約8min后取出，將心臟切為約2mm的切片，隨后進(jìn)行2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-Triphenyltetrazoliumchloride，TTC)染色，染色結(jié)束后用掃描儀掃描圖像并保存，用圖像分析軟件分析缺血面積及梗死面積，并根據(jù)結(jié)果計算缺血范圍及梗死范圍。
　　 再選擇同樣體重范圍的雄性Wistar大鼠84只，隨機分為缺血/再灌注組（I/R組）和假手術(shù)組(sha

5、m組)，每組42只，I/R組及sham組再按不同再灌注時間點(1、2、4、6、12、24h和7d)隨機分為7組，每組6只。再灌注模型建立后，在達(dá)到預(yù)定時間點后開胸分離出心臟，從主動脈弓水平剪下心臟，用冰生理鹽水沖洗干凈后置于干凈培養(yǎng)皿中，于冰箱預(yù)冷約8min，取出后棄去心尖部及心底部，將心臟切成厚度約2mm的心肌切片，其中一片放入包埋框進(jìn)行石蠟包埋后切片染色，染色包括HE染色和免疫組化染色。另外的心肌切片去除右室后，按缺血梗死區(qū)及室間隔

6、分別裝入不同的凍存管內(nèi)，置于液氮中1h后存于冰箱中，待以后研磨提取RNA及PCR。實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(realtime-polymerasechainreaction，RT-PCR)定量檢測心肌組織TLR2及TLR4mRNA水平。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranscriptase-polymerasechainreaction，rt-PCR)測定心肌白介素-6(IL-6)和單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)的mRNA水平

7、。免疫組化檢測心肌TLR2、TLR4及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:(1)心肌組織酞菁藍(lán)及TTC雙染結(jié)果:隨著再灌注時間的延長，缺血范圍(risksize，RS)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，而心肌梗死范圍(infarctsize，IS)逐漸增大，在再灌注2h時達(dá)峰值后一直穩(wěn)定在平臺期，再灌注7d時左心室游離壁顯著變薄，室間隔明顯增厚，心室已發(fā)生重構(gòu)。
　　 (2)HE染色結(jié)果:在再灌注早期，sham組心肌組

8、織形態(tài)未見明顯改變，而I/R組心肌結(jié)構(gòu)均有不同程度損傷，雖然心肌組織恢復(fù)了血供，但是心肌損傷并沒有改善，而損傷仍在繼續(xù)。在復(fù)灌7d時可見心室重塑，左室壁厚度明顯變薄，大量成纖維細(xì)胞替代原有的心肌細(xì)胞。
　　 (3)免疫組化結(jié)果:與sham組相比，TLR2和TLR4的蛋白水平均有升高，到再灌注4h時達(dá)高峰，隨后逐漸下降，至第7d時有再次升高趨勢，但與24h組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。TNF-α蛋白從缺血/再灌注1h起就有升高，在再灌注

9、6h達(dá)高峰之后有小幅度下降。TLR2及TLR4蛋白水平正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.935，P＜0.01，TLR4蛋白與TNF-α蛋白表達(dá)量也成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=0.818(P＜0.05)，而TLR2與TNF-α蛋白表達(dá)量無相關(guān)。
　　 (4)RT-PCR結(jié)果:sham組和I/RR組TLR2、TLR4mRNA水平均出現(xiàn)不同程度上升，其中TLR4在再灌注4h時達(dá)高峰(vs.sham組，2.71±0.30，P＜0.01)，隨后逐漸下降

10、，至再灌注7d時TLR4水平有再次回升趨勢。TLR2也在再灌注4小時到高峰(vs.sham組，3.95±0.58，P＜0.01)，之后逐漸下降。至第7天時未見上升趨勢。TLR2mRNA的表達(dá)量與TLR4mRNA的表達(dá)量成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.844，P＜0.01。
　　 (5)rt-PCR結(jié)果:IL-6在4h達(dá)到高峰(3.36±0.41，P＜0.01)后開始下降，到24h時基本降至正常水平，在再灌注7d時未見明顯上升。MCP-

11、1在缺血/再灌注后一直保持與sham組相當(dāng)水平，在再灌注7d時才有明顯升高(1.97±0.51，P＜0.01)。TLR2及TLR4mRNA的表達(dá)量均與IL-6mRNA的表達(dá)量成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.813(P＜0.01)，r=0.791(P＜0.01)。
　　 (6)TLRs與梗死范圍相關(guān)關(guān)系:除去再灌注1h的時間點，24h內(nèi)TLR2mRNA及TLR4mRNA與梗死范圍均正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.936(P＜0.05

12、),r=0.907(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:在心肌缺血/再灌注早期，心肌組織中TLR2和TLR4基因及蛋白水平迅速上調(diào)，早期促進(jìn)下游炎癥因子IL-6和TNF-α的產(chǎn)生造成心肌結(jié)構(gòu)的損傷。在再灌注后期，TLR2和TLR4的再次升高可能使得晚期炎癥因子MCP-1的表達(dá)增加，從而損傷心肌結(jié)構(gòu)及功能，導(dǎo)致心肌重塑。TLR2與TLR4之間存在相關(guān)性，說明可能兩種TLRs之間存在某種相互聯(lián)系，互相促進(jìn)各自的表達(dá)，在炎癥過程中作為一個相