增齡和不同熱量飲食對大鼠腎臟自噬的影響.pdf

1、目的：目前我國已進入老齡化社會,衰老問題已成為國家與社會面臨的重大問題之一。因此,急需加深對腎臟衰老機制的認識并探索延緩腎臟衰老的策略,從而減少老年腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展。目前認為衰老從本質(zhì)上是受損和缺陷細胞成分不斷在細胞內(nèi)聚集,最終引起細胞和組織生理功能下降,導致機體衰老。自噬(autophagy),即自我吞噬作用(autophagocytosis),是存在于真核生物細胞中的一種高度保守的、維持細胞內(nèi)環(huán)境自身穩(wěn)定的重要保護性機制。在生理

2、情況下,自噬可以清除細胞內(nèi)少量受損的細胞器和大分子聚集物,因此,當自噬受損傷或自噬缺陷時,機體有可能出現(xiàn)衰老和衰老相關疾病。研究表明能量代謝異常與衰老的發(fā)生發(fā)展密切相關。限制熱量攝入是已經(jīng)得到公認的唯一可以延緩多個物種衰老速率,延長平均和最大壽命的干預方法。但是,目前對于限制熱量攝入延緩衰老的分子機理還不很清楚。本研究擬通過觀察3,12和24月齡Fischer344大鼠腎臟自噬功能的改變,明確衰老對腎臟自噬功能的影響；同時探討高熱量飲食

3、和限制熱量攝入對老齡大鼠腎臟自噬功能的影響,這對于理解腎臟衰老和腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展機制以及探索延緩衰老相關腎臟疾病新的治療方案具有重要的意義。
　　 方法：⑴取3月齡、12月齡和24月齡大鼠(每組10只)的腎臟組織,用PAS染色檢測大鼠腎臟病理變化。用real time-PCR及Western blot,觀測自噬相關基因(autophagy related genes,Atg)LC3/Atg8、beclin-1/Atg6、At

4、g5、Atg7,溶酶體組織蛋白酶B以及泛素結合蛋白p62/SQSTM1和多聚泛素聚集體(polyubiquitin aggregates)的表達變化。用免疫組化法觀察DNA損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧烏苷(8-OHdG)在腎組織中的定位和表達。用免疫熒光法檢測8-OHdG和LC3在腎組織的定位和表達變化。分別用衰老相關β-半乳糖苷酶活性(SA—β-gal)染色方法和Western blot檢測SA-β-gal活性變化和衰老標志蛋白p16。用透射

5、電鏡檢測腎臟細胞線粒體的結構變化。⑵將3月齡雄性Fischer344大鼠63只隨機分為3組:①正常飲食組:26只,自由飲食飲水,；②熱量限制組:16只,限制至正常食量的70％；③高熱量飲食組:21只,自由進食高熱量飼料。待大鼠飼養(yǎng)至24月齡時,處死留取24小時尿液,取血。檢測血生化、腎功能(Scr、BUN)和尿蛋白/肌酐。大鼠處死時,測量大鼠體重,身長,腎重。留取腎臟組織液氮凍存,OCT包埋和10％甲醛固定。分別用于檢測p16蛋白和SA

6、—β—gal、自噬相關蛋白Atg、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化損傷產(chǎn)物丙二醛(MDA)和蛋白質(zhì)羰基,8-OHdG的變化,采用PAS染色檢測大鼠腎臟病理改變。
　　 結果：首先觀察了衰老過程中腎臟自噬功能的變化。①Western blot顯示,與3月齡和12月齡大鼠相比,24月齡大鼠腎臟中衰老標志物p16表達水平顯著以及衰老相關β-半乳糖苷酶活性與3月齡、12月齡相比顯著增加。②Western blot顯示,與3月齡大鼠腎臟組織相比,24月齡

7、大鼠自噬標志物LC3-Ⅰ隨增齡顯著降低,LC3-Ⅱ隨增齡變化不明顯。免疫熒光結果顯示24月齡大鼠腎臟LC3表達顯著降低。③定量PCR結果顯示,在大鼠腎臟中,Atg7的表達隨增齡顯著降低。④Western blot結果顯示,泛素結合蛋白p62/SQSTM1和多聚泛素聚集體polyubiqintin aggregates隨增齡在24月齡大鼠腎臟組織中表達顯著升高。Beclin-1/Atg6隨增齡改變不明顯。組織蛋白酶B在24月齡組大鼠腎臟中

8、表達顯著降低。⑤免疫熒光和免疫組化結果顯示,在12月齡和24月齡大鼠腎臟中,DNA損傷產(chǎn)物8-OHdG的表達顯著高于3月齡大鼠。⑥透射電鏡觀察顯示:12月齡和24月齡大鼠的腎臟組織中,腎小管上皮細胞中線粒體出現(xiàn)腫脹變形和線粒體嵴結構的紊亂。⑦腎組織PAS染色顯示:與3月齡相比,24月齡大鼠腎小球硬化明顯。腎小管間質(zhì)可見炎細胞浸潤,小管萎縮。進一步探討了不同熱量飲食干預對腎臟自噬的功能影響。①與正常飲食組相比,高熱量飲食組大鼠腎臟中p16

9、表達顯著增加,熱量限制組顯著降低。②與正常飲食組大鼠腎臟組織相比,高熱量飲食組大鼠腎臟組織LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ顯著降低,熱量限制組大鼠腎組織LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ顯著增高。免疫熒光結果顯示熱量限制組大鼠腎臟組織LC3表達高于正常飲食組,高熱量飲食組LC3表達低于正常飲食組。③與正常飲食組大鼠腎臟相比,p62/SQSTM1和polyubiqintin aggregates在熱量限制組大鼠腎臟組織中表達顯著降低,而高熱量飲食組顯著升高。④

10、免疫熒光結果顯示,與正常飲食組相比,高熱量飲食組8-OHdG的表達升高,熱量限制組8-OHdG的表達降低。⑤氧化損傷標志物羰基和丙二醛(MDA)的檢測顯示,高熱量飲食組顯著高于正常飲食組,熱量限制組顯著低于正常飲食組。⑥腎組織PAs染色顯示:與正常飲食組相比,高熱量飲食組腎小球系膜細胞增殖程度和腎小管間質(zhì)炎細胞浸潤加重,熱量限制組腎小球系膜細胞增殖程度和腎小管間質(zhì)炎細胞浸潤較輕。
　　 結論：在大鼠腎臟的自噬功能隨著增齡而下降,