SFTSV感染對(duì)宿主固有免疫關(guān)鍵分子表達(dá)調(diào)節(jié)及IFITM3對(duì)其抑制作用.pdf

1、發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）是近年來(lái)在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的一種新型病毒，屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬成員。它可以引起人患發(fā)熱伴血小板減少綜合征，主要以發(fā)熱、血小板減少，白細(xì)胞減少及胃腸疾病，嚴(yán)重者因多器官功能衰竭而死，致死率高達(dá)10~30％。對(duì)于該病目前沒(méi)有有效的治療方法，對(duì)人們的生命健康造成巨大的威脅。因此，探索SFTSV的致病機(jī)理及宿主抗病毒機(jī)制將為開(kāi)發(fā)有效的預(yù)防與治療方法奠定理論基礎(chǔ)。
　　宿主天然免疫反應(yīng)是抵御多種病毒

2、感染的第一道防線，此反應(yīng)主要由I型干擾素誘導(dǎo)和NK細(xì)胞的活化而啟動(dòng)。Toll樣受體（TLRs）和RIG-I受體在干擾素抗病毒過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。I型干擾素誘導(dǎo)之后，酪氨酸激酶信號(hào)在轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK/STAT）信號(hào)通路通過(guò)加強(qiáng)STAT1的磷酸化水平和干擾素刺激基因反應(yīng)元件（ISRE）活性而激活，導(dǎo)致產(chǎn)生幾百種干擾素刺激基因（ISGs），從而細(xì)胞表現(xiàn)出抗病毒作用，限制病毒的復(fù)制和蔓延。
　　干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白是I型干擾素

3、刺激產(chǎn)生一種小分子跨膜蛋白，是一種能夠阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞的宿主限制因子。干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白主要包括IFITM1、IFITM2和IFITM3，均具有廣譜的抗病毒作用。目前，已研究證明IFITMs對(duì)裂谷熱病毒等幾種布尼亞病毒表現(xiàn)明顯的抑制作用，而對(duì)SFTSV感染的影響未有相關(guān)報(bào)道。
　　研究目的：
　　初步探索SFTSV感染對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)固有抗病毒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及抗病毒限制因子IFITMs等的調(diào)控作用。目前，IFITM3對(duì)SFTSV抑

4、制作用沒(méi)有相的關(guān)報(bào)道，因此本研究通過(guò)分析SFTSV感染對(duì)包括IFITM蛋白在內(nèi)的抗病毒通路關(guān)鍵分子的表達(dá)調(diào)控作用及IFITM3對(duì)SFTSV感染的影響，探討IFITM3與SFTSV間的關(guān)系及其抗病毒作用機(jī)制。SFTSV仍無(wú)有效的藥物或疫苗，完成本次研究為開(kāi)發(fā)特異藥物分子或治療方法提供新的思路和角度。
　　研究?jī)?nèi)容：
　　1.SFTSV對(duì)固有免疫關(guān)鍵分子的調(diào)控
　　2.誘導(dǎo)表達(dá)IFITM3穩(wěn)定HEK293細(xì)胞系的建立

5、>　　3.IFITM3抑制發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒感染
　　研究方法：
　　1.SFTSV對(duì)固有免疫關(guān)鍵分子的調(diào)控
　　根據(jù)天然免疫信號(hào)通路上的關(guān)鍵分子，我們選擇TLR3~8、RIG-I、MDA5、MyD88、TBK-1、IRF7、IFN-β、STAT1~6、IFITM1、IFITM2、IFITM3、PKR、Mx1、OAS1、ISG15及ISG56相關(guān)分子26個(gè)，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)感染SFTSV不同時(shí)間點(diǎn)的固有免

6、疫關(guān)鍵分子表達(dá)變化，評(píng)價(jià)SFTSV對(duì)天然免疫信號(hào)通路的影響。SFTSV感染HEK293和A549細(xì)胞24h后，經(jīng)IFN-α處理12h后，檢測(cè)JAK/STATs途徑相關(guān)分子STAT1、STAT2、IRF9、IFITM1、IFITM2和IFITM3基因表達(dá)情況。
　　2.誘導(dǎo)表達(dá)IFITM3穩(wěn)定HEK293細(xì)胞系的建立
　　利用Tet-On3G誘導(dǎo)型真核表達(dá)系統(tǒng)，將以構(gòu)建好的pTRE3G-IFITM3和pLVX-Tet3G共轉(zhuǎn)染

7、于293細(xì)胞，在G418和puro加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)IFITM3的誘導(dǎo)型293細(xì)胞系，并經(jīng)Western-blot、MTS和流式細(xì)胞術(shù)分析鑒定。
　　3.IFITM3抑制發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒感染
　　本實(shí)驗(yàn)用SFTSV感染293-Tet3G-IFITM3和已構(gòu)建好的MDCK-Tet3G-IFITM3后，通過(guò)間接免疫熒光，熒光定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)分析評(píng)價(jià)IFITM3對(duì)SFTSV感染或進(jìn)入的抑制作用。
　　研究結(jié)

8、果：
　　1.通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)在SFTSV感染THP-1細(xì)胞情況下Toll樣受體（TLRs）及其下游分子TBK-1、MyD88、STAT1~6、IFITM1、IFITM2、IFITM3、PKR、Mx1、OAS1、ISG15及ISG56等天然免疫信號(hào)通路的關(guān)鍵分子表達(dá)變化，結(jié)果表明，SFTSV感染THP-1細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)，在Toll樣受體TLR3~TLR8中，主要以TLR7和TLR8基因表達(dá)上調(diào)，在RIG-I受體中，RIG-

9、I和MDA5基因表達(dá)極大的上調(diào)，且其下游的MyD88表達(dá)稍微增強(qiáng)，IRF7和IFN-β顯著增強(qiáng)；在JAK/STAT途徑中， STAT1和STAT2表達(dá)顯著升高，而且其下游的干擾素刺激基因IFITM1、IFITM3、PKR等明顯上調(diào)。以上結(jié)果提示，SFTSV感染THP-1細(xì)胞后，宿主細(xì)胞啟動(dòng)抗病毒天然免疫反應(yīng)。IFN-α處理 SFTSV感染的HEK293和A549細(xì)胞，STAT1、STAT2、IRF9、IFITM1、IFITM2和IFIT

10、M3基因表達(dá)水平均低于IFN-α處理的正常細(xì)胞，暗示SFTSV能夠抑制外源性IFN-α誘導(dǎo)的信號(hào)通路。
　　2.利用Tet On3G誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)，將攜帶IFITM3的反應(yīng)載體和調(diào)控載體共轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞內(nèi)，在嘌呤霉素和G418加壓下獲得穩(wěn)定表達(dá)IFITM3的誘導(dǎo)型HEK293細(xì)胞系，即293-Tet3G-IFITM3，并經(jīng)Western-blot、MTS和流式細(xì)胞術(shù)分析鑒定正確。結(jié)果表明293-Tet3G-IFITM3穩(wěn)定

11、表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功，Dox對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的IFITM3細(xì)胞活力沒(méi)有明顯影響，表達(dá)IFITM3的細(xì)胞接近100%。
　　3.通過(guò)SFTSV感染實(shí)驗(yàn)，IFA結(jié)果表明Dox誘導(dǎo)表達(dá)IFITM3的HEK293和MDCK細(xì)胞能夠抵抗SFTSV感染。RT-qPCR結(jié)果表明：Dox誘導(dǎo)表達(dá)的IFITM3能夠抑制SFTSV的早期(12h)感染。FCM檢測(cè)結(jié)果表明：Dox誘導(dǎo)表達(dá)IFITM3可以抑制SFTSV感染；低pH能夠增強(qiáng)SFTSV感染，但不影響