心肌缺血預(yù)適應(yīng)大鼠循環(huán)血中微囊泡通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮抗大鼠心肌缺血-再灌注損傷.pdf

1、目的：
　　建立大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)模型，提取循環(huán)血中的微囊泡(IPC-MVs)。對(duì)IPC-MVs進(jìn)行表型鑒定及數(shù)量分析，并探討IPC-MVs對(duì)大鼠在體心肌缺血/再灌注(I/R)損傷的作用及與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)的作用機(jī)制。方法：
　　1.大鼠在體心肌I/R損傷及IPC模型的建立
　　健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)(Sham), I/R及IPC組。Sham組：冠狀動(dòng)脈左前降支

2、(LAD)下穿線后不予結(jié)扎；I/R組：LAD下穿線行心肌缺血30 min及再灌注120 min處理，對(duì)心肌造成I/R損傷；IPC組：LAD下穿線行心肌缺血5 min及再灌注5 min，循環(huán)3次的短暫I/R預(yù)處理，再行缺血30 min及再灌注120 min的I/R處理。監(jiān)測(cè)Ⅱ?qū)?lián)心電圖(ECG)、動(dòng)脈收縮壓(SBP)及舒張壓(DBP)，監(jiān)測(cè)缺血期各類室性心律失常(VA)發(fā)生情況，臺(tái)盼藍(lán)/TTC染色檢測(cè)心肌梗死面積。
　　2. IPC

3、-MVs的提取、表型鑒定及計(jì)數(shù)
　　健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為2組：Sham及IPC組。Sham組：LAD下穿線后不阻斷血流，曠置30min；IPC組：LAD下穿線后行缺血5 min及再灌注5 min，循環(huán)3次后自腹主動(dòng)脈取血，血液經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝并經(jīng)兩步離心得到無(wú)血小板血漿(PFP)。取90μL PFP運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)MVs進(jìn)行表型鑒定及計(jì)數(shù)。剩余PFP經(jīng)超速離心得到IPC-MVs，用于后期處理大鼠。在PFP中分別加入血小板

4、、內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞及紅細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD61, CD144, CD45及Erythroid Cells單抗，并加入1,2μm的標(biāo)準(zhǔn)微球流式上機(jī)檢測(cè)。
　　3.IPC-MVs對(duì)I/R大鼠MAP, HR,ST-段水平及心肌組織壞死的影響
　　健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：Sham, I/R及IPC-MVs+I/R組。Sham組：LAD下穿線后不阻斷血流，曠置150 min，于曠置25 min自股靜脈注射相應(yīng)體積的生理鹽

5、水(NS)；I/R組：給予I/R處理，于缺血25 min注射相應(yīng)體積的NS；IPC-MVs+I/R組：給予I/R處理，于缺血25 min注射依蛋白定量計(jì)算后的IPC-MVs7 mg/kg。監(jiān)測(cè)ECG,SBP及DBP，記錄缺血期VA發(fā)生情況，微板法檢測(cè)血清乳酸脫氫酶(LDH)活力，臺(tái)盼藍(lán)/TTC染色測(cè)定心肌梗死面積，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察心肌組織形態(tài)改變。
　　4. IPC-MVs對(duì)I/R大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響
　　實(shí)驗(yàn)

6、分組同方法3。原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，微量酶標(biāo)法檢測(cè)心肌組織Caspase3活力。
　　5. IPC-MVs對(duì)I/R大鼠心肌組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　實(shí)驗(yàn)分組同方法3。微量酶標(biāo)法檢測(cè)心肌組織Caspase12活力，Western blot法檢測(cè)心肌組織葡萄糖調(diào)控蛋白78(GRP78)及轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立大鼠在

7、體心肌I/R損傷及IPC模型
　　大鼠心肌I/R損傷模型建立成功。與缺血前相比，缺血立即平均動(dòng)脈壓(MAP)顯著下降且ST-段顯著抬高(56.62±9.10 mmHgvs85.86±10.71 mmHg;0.322±0.034 mVvs0.012±0.031 mV,P<0.001)，至缺血30 min末，ST-段抬高至峰值(0.500±0.060mV)。心率(HR)于I/R期間進(jìn)行性下降，至再灌注120 min末，HR較缺血前相比

8、明顯降低(285±22次/min vs464±20次/min, P<0.001)。缺血期室早(VPC)首次出現(xiàn)時(shí)間早(6.54±1.11 min)，室早個(gè)數(shù)為205±33；室速(VT)首次出現(xiàn)時(shí)間早(8.36±1.28min)，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)(0.68±0.41min)，二者發(fā)生率均為100％；室顫(VF)發(fā)生率為75%。心肌組織梗死區(qū)/危險(xiǎn)區(qū)(IS/AAR)為43.04±6.26%。
　　與I/R組相比，IPC組缺血期末ST-段抬高

9、幅度顯著降低(0.403±0.043 mV vs0.500±0.060 mV, P<0.01)，再灌注末HR顯著恢復(fù)(327±11次/min vs285±22次/min,P<0.01)。缺血期VPC(16.49±9.49minvs6.54±1.11 min,P<0.01)及VT(15.23±2.40 min vs8.36±1.28 min, P<0.001)首次出現(xiàn)時(shí)間明顯推遲，VPC個(gè)數(shù)明顯減少(15±23 vs205±33, P<0

10、.001)，VT持續(xù)時(shí)間明顯縮短(0.12±0.18 min vs0.68±0.41min,P<0.05)，VT及VF的發(fā)生率降低(37.5%vs100%;0%vs75%, P<0.01)；心肌梗死面積明顯縮小(18.76±4.18%vs43.04±6.26%, P<0.001)。大鼠心肌IPC模型建立成功。
　　2. IPC-MVs的提取、表型鑒定及計(jì)數(shù)
　　大鼠循環(huán)血經(jīng)2,600 g，15 min和10,000 g，5

11、min兩步離心得到PFP。采用33,000 rpm,148 min，4℃離心得到IPC-MVs。流式檢測(cè)的1μm以下且對(duì)應(yīng)熒光抗體呈陽(yáng)性的微粒即定義為不同細(xì)胞來(lái)源的 IPC-MVs。與 Sham組相比， IPC-MVs中血小板來(lái)源MVs(PMVs,1094±181 events/μL vs719±115 events/μL, P<0.05)、內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源 MVs(EMVs,475±42 events/μL vs388±34 events

12、/μL,P<0.05)和紅細(xì)胞來(lái)源MVs(RMVs,1539±212 events/μL vs1200±171 events/μL, P<0.05)的數(shù)量均顯著增加，但 MVs總數(shù)(4380±745 events/μL vs3453±307 events/μL)和白細(xì)胞來(lái)源MVs(LMVs,117±20events/μLvs91±11 events/μL)的數(shù)量無(wú)顯著性變化。
　　3.IPC-MVs改善I/R大鼠HR, ST-段水

13、平并減輕心肌組織壞死程度
　　I/R及IPC-MVs+I/R組全程MAP變化趨勢(shì)一致，組間無(wú)顯著性差別。全程HR變化趨勢(shì)一致，至再灌注120 min末，IPC-MVs+I/R組HR較I/R組明顯恢復(fù)(331±9次/min vs305±13次/min, P<0.01)；兩組缺血期ST-段均進(jìn)行性抬高，再灌注后逐漸回落。至再灌注120 min末，與I/R組相比，IPC-MVs+I/R組ST-段水平顯著降低(0.043±0.027 mV

14、vs0.097±0.056 mV,P<0.05)；組間缺血期VA發(fā)生情況無(wú)顯著性差異。與Sham組相比，I/R及IPC-MVs+I/R組血清LDH活力于缺血30 min及再灌注120 min均顯著升高(P<0.001)，與I/R組相比， IPC-MVs+I/R組LDH活力于再灌注120 min明顯下降(10.975±1.005 U/mLvs12.910±1.111 U/mL,P<0.01)。IPC-MVs+I/R組心肌梗死面積較I/R組

15、顯著縮小(29.63±3.90%vs40.50±2.54%,P<0.001)，提示心肌組織損傷程度明顯減輕。
　　4. IPC-MVs抑制I/R誘發(fā)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡
　　與I/R組相比，IPC-MVs+I/R組心肌細(xì)胞AI顯著降低(22.98±1.61%vs34.14±1.26%,P<0.001)。心肌組織Caspase3活力較I/R組顯著下降(54.35±3.75 U/μgvs71.23±4.35 U/μg,P<0.00

16、1)。
　　5. IPC-MVs通過(guò)抑制ERS抗I/R大鼠心肌損傷
　　IPC-MVs+I/R組心肌組織Caspase12活力較I/R組顯著下降43%(P<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與I/R組相比，IPC-MVs+I/R組GRP78及CHOP的蛋白表達(dá)量均顯著下降(0.47±0.07% vs0.77±0.10%, P<0.001;0.68±0.07% vs0.89±0.10%, P<0.01)。

17、>　　結(jié)論：
　　1.成功建立大鼠在體心肌I/R損傷及IPC模型。
　　2.流式檢測(cè)證實(shí)粒徑小于1μm的微粒即為IPC-MVs，且來(lái)源于血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞和紅細(xì)胞。其中PMVs, EMVs及RMVs的數(shù)量顯著增加。
　　3.靜脈注射7 mg/kg的IPC-MVs可顯著恢復(fù)I/R大鼠再灌注末HR，降低再灌注末ST-段水平和血清LDH活力，縮小心肌梗死面積，減輕組織壞死程度。
　　4.靜脈注射7 mg/kg的I