SIRT1激活對Klotho基因缺陷誘導的動脈硬化及高血壓的作用及機制的研究.pdf

1、動脈硬化和高血壓病是常見的心血管疾病，發(fā)病率隨年齡增加而增加，嚴重威脅老年人群的生活和健康。根據(jù)JNC-7（Seventh Report of the Joint National Committee）的報道，三分之二65歲以上的老年人患有高血壓病。動脈硬化是隨著年齡增長而出現(xiàn)的血管疾病，其病理基礎(chǔ)為大血管壁中彈性纖維逐漸斷裂、丟失伴隨膠原纖維逐漸積聚，使動脈管壁增厚、變硬，進而失去彈性。動脈硬化是心血管事件的獨立預測因子，且其發(fā)生獨立

2、于動脈粥樣硬化的形成。動脈硬化和高血壓有著密切的聯(lián)系，有研究表明動脈硬化的形成可預測收縮壓的增高。本課題組近期研究顯示Klotho基因缺陷誘導動脈硬化的形成先于高血壓的發(fā)生，然而，其機制尚不完全清楚。本文運用Klotho基因缺陷雜合子小鼠作為老年動物模型，分為以下三部分對Klotho和SIRT1的關(guān)系及其在動脈硬化和高血壓的形成機制中的作用進行初步研究。本研究分為三個部分：
　　第一部分：Klotho基因缺陷抑制主動脈SIRT1活

3、性和蛋白表達，誘導動脈硬化及高血壓形成。
　　目的：檢測動脈硬化伴有高血壓患者循環(huán)血中抗衰老基因 Klotho蛋白含量，證實動脈硬化伴有高血壓患者血中Klotho蛋白水平降低；檢測Klotho對主動脈中SIRT1活性及蛋白表達量和對血壓及大動脈彈性的影響，證實Klotho參與高血壓及動脈硬化的形成，此效應與其抑制主動脈中SIRT1活性及其蛋白表達相關(guān)。
　　方法：⑴收集動脈硬化伴有高血壓患者相關(guān)臨床資料及血清標本， ELIS

4、A法檢測血清中Klotho蛋白水平。⑵構(gòu)建Klotho基因缺陷雜合子小鼠動物模型。⑶采用脈搏波傳導速度法監(jiān)測小鼠動脈彈性變化。⑷采用無創(chuàng)尾動脈血壓檢測法監(jiān)測小鼠血壓（blood pressure, BP）變化。⑸采用免疫印跡法檢測小鼠主動脈SIRT1活性及蛋白表達量的改變。⑹采用免疫印跡法檢測檢測小鼠血漿中Klotho蛋白含量。
　　結(jié)果：①ELISA結(jié)果顯示，與正常對照組相比，動脈硬化及高血壓患者血清中Klotho蛋白含量降低約

5、45％（P<0.05）。臨床基線資料結(jié)果顯示，與正常對照組相比，動脈硬化及高血壓患者組baPWV和BP顯著性升高（P<0.001）；而兩組間年齡、體重指數(shù)、血糖、血脂、血肌酐水平無統(tǒng)計學差異。②采用超聲多普勒法檢測小鼠胸主動脈-腹主動脈脈搏波傳導速度（Pulse wave velocity, PWV）以評價小鼠大動脈彈性。經(jīng)過為期3個月的監(jiān)測，結(jié)果顯示，與對照組相比，Klotho基因缺陷小鼠PWV持續(xù)升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.00

6、1），此結(jié)果提示Klotho基因缺陷能誘導動脈硬化形成。同時，我們采用無創(chuàng)尾動脈血壓檢測法監(jiān)測小鼠血壓變化。實驗結(jié)果顯示，與PWV結(jié)果一致，同對照組比較，KL+/-小鼠血壓顯著且持續(xù)性升高（P<0.001），表明Klotho基因缺陷能誘導高血壓形成。③免疫印跡法結(jié)果顯示，與 WT組相比，KL+/-小鼠主動脈中 SIRT1蛋白含量及活性均顯著性降低（P<0.05），提示 Klotho基因缺陷下調(diào)主動脈中SIRT1蛋白活性及表達量。④小鼠循

7、環(huán)血中Klotho蛋白含量檢測顯示，與對照組相比，KL+/-小鼠血漿中Klotho蛋白水平顯著性降低，提示此動物模型能有效模擬動脈硬化及高血壓患者的機體內(nèi)環(huán)境。
　　結(jié)論：Klotho基因缺陷誘導動脈硬化及高血壓的形成，同時抑制主動脈中SIRT1活性及蛋白表達量。
　　第二部分：SIRT1激活改善Klotho基因缺陷誘導的動脈硬化及高血壓。
　　目的：探討SIRT1激活對大動脈彈性及血壓的干預，證實SIRT1激活可顯著

8、改善Klotho基因缺陷誘導的動脈硬化及高血壓。
　　方法：⑴采用SIRT1激活劑SRT1720對小鼠進行腹腔注射，劑量為15mg/kg/d，共19天，對照組給予同等體積的生理鹽水。⑵藥物干預過程中，持續(xù)監(jiān)測小鼠 PWV和 BP變化，藥物干預19天后，在麻醉狀態(tài)下采用經(jīng)導管有創(chuàng)血壓檢測法直接測量主動脈血壓，以確認無創(chuàng)尾動脈血壓結(jié)果。⑶檢測血漿Klotho蛋白含量。⑷采用免疫組化及免疫印跡法檢測主動脈SIRT1活性、蛋白含量及其在主

9、動脈細胞中的分布情況。⑸采用Masson's trichrome染色法檢測主動脈壁中膠原纖維的變化，免疫印跡法測定主動脈中I型膠原蛋白的含量。⑹采用Verhoeff's彈性纖維染色法檢測主動脈壁中彈性纖維的變化，免疫印跡法測定主動脈中彈性蛋白的含量。
　　結(jié)果：①實驗結(jié)果顯示，SIRT1激活劑干預后第6天，KL+/-組小鼠PWV值即顯著下降（P<0.01 vs KL+/-+Saline），恢復至WT組水平。SRT1720干預并未影

10、響正常對照組的PWV水平。此結(jié)果提示，SIRT1激活可顯著改善Klotho基因缺陷誘導的動脈硬化。②無創(chuàng)尾動脈血壓測定結(jié)果顯示， Klotho基因缺陷組小鼠血壓在SRT1720干預后第3天開始顯著性降低（P<0.001 vs KL+/-+Saline），干預后第6天降至WT組水平。SIRT1激活劑干預并未影響WT小鼠的BP水平。有創(chuàng)主動脈血壓檢測驗證了這一結(jié)果。此結(jié)果提示，SIRT1激活可顯著改善Klotho基因缺陷誘導的高血壓，但并不

11、影響正常血壓。③免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，SRT1720治療組的 KL+/-小鼠血漿中 Klotho蛋白含量無變化，提示 SIRT1激活并不影響循環(huán)血中Klotho水平，故SIRT1激活至少不能直接調(diào)控Klotho蛋白的表達。④免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)SRT1720干預后，KL+/-組小鼠主動脈SIRT1活性顯著性升高（P<0.01 vs KL+/-+ Saline），恢復至 WT組水平。免疫組化結(jié)果顯示，SIRT1在主

12、動脈內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞中均有表達，絕大多數(shù)分布在細胞核內(nèi)。半定量分析顯示，與WT組相比，SIRT1蛋白在 KL+/-組小鼠主動脈的內(nèi)膜和中膜上的表達量均顯著性減少（P<0.01 vs WT+Saline），經(jīng)SRT1720干預后，SIRT1在主動脈內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞中的表達明顯增多（P<0.01 vs KL+/-+Saline），此結(jié)果與免疫印跡結(jié)果完全吻合。提示 SRT1720對 SIRT1的激活效應可能是通過上調(diào)其蛋白表達量實現(xiàn)

13、的。⑤SIRT1激活顯著改善由Klotho基因缺陷誘導的主動脈壁結(jié)構(gòu)改變，增加彈性蛋白表達，減少I型膠原蛋白表達。Masson's trichrome染色和Verhoeff's彈性纖維染色法結(jié)果顯示，與WT組相比，KL+/-組小鼠主動脈壁中膠原沉積量顯著增加（P<0.01），與之伴隨的是主動脈壁中彈力板的斷裂數(shù)量明顯降低，為Klotho基因缺陷誘導的動脈硬化提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。免疫印跡法結(jié)果顯示，KL+/-組小鼠主動脈中I型膠原蛋白的表達量

14、明顯增加（P<0.05），伴有彈性蛋白的表達顯著性降低（P<0.01）。經(jīng)SRT1720治療后，上述動脈硬化相關(guān)變化被顯著性改善（P<0.05），與WT組無統(tǒng)計學差異。提示SIRT1活化通過調(diào)控主動脈中I型膠原蛋白和彈性蛋白的表達量，改善Klotho基因缺陷誘導的動脈硬化相關(guān)的主動脈壁結(jié)構(gòu)重塑。
　　結(jié)論：SIRT1激活能顯著性改善Klotho基因缺陷誘導的動脈硬化和高血壓，但不影響血漿Klotho水平。
　　第三部分：SI

15、RT1激活改善Klotho基因缺陷誘導的動脈硬化及高血壓機制的研究。
　　目的：探討SIRT1激活改善Klotho基因缺陷誘導的動脈硬化及高血壓的機制，證實此效應系通過SIRT1上調(diào)主動脈中AMPKα和eNOS的活性，抑制NADPH氧化酶和超氧化物生成而實現(xiàn)的。
　　方法：⑴采用免疫組化和免疫印跡法檢測主動脈中磷酸化 AMPKα（ phosphorated- AMPKα, p-AMPKα）和總 AMPKα（ total- A

16、MPKα, t-AMPKα）的表達。⑵采用免疫組化和免疫印漬法檢測主動脈中磷酸化 eNOS（phosphorated-eNOS, p-eNOS）和總eNOS（total-eNOS, t-eNOS）的表達。⑶采用lucigenin化學發(fā)光法檢測主動脈中NADPH氧化酶活性。⑷采用DHE染色檢測主動脈中超氧化物的含量。
　　結(jié)果：①免疫印跡結(jié)果顯示，與WT組相比，KL+/-組小鼠主動脈中p-AMPKα蛋白含量顯著降低（P<0.001

17、vs WT+Saline），而t-AMPKα含量無明顯差異，提示Klotho基因缺陷抑制了主動脈中AMPKα活性。SRT1720干預后，p-AMPKα蛋白含量明顯增高（P<0.001 vs KL+/-+Saline），而t-AMPKα蛋白表達量未受影響，此結(jié)果表明，SIRT1活化可使主動脈AMPKα活性顯著增高。免疫組化實驗結(jié)果顯示了p-AMPKα和t-AMPKα在細胞內(nèi)的分布情況，二者在主動脈內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞中均有表達，其中，在內(nèi)

18、皮細胞的細胞核和細胞漿中均可見陽性染色，而在平滑肌細胞中則主要表達在細胞漿中。半定量分析結(jié)果與免疫印跡結(jié)果一致，提示Klotho基因缺陷顯著性抑制了主動脈中AMPKα活性，SIRT1激活劑治療后可解除此抑制效應。②同AMPKα相似，免疫印跡結(jié)果顯示，與WT組相比，KL+/-組小鼠主動脈中p-eNOS蛋白含量顯著降低（P<0.001 vs WT+Saline），而t-eNOS蛋白含量無明顯差異，提示 Klotho基因缺陷抑制了主動脈中eN

19、OS活性。經(jīng)SRT1720干預后，p-eNOS蛋白含量明顯升高（P<0.001 vs KL+/-+Saline），而t-eNOS蛋白表達量未受影響，因此，SIRT1激活可顯著增加主動脈eNOS活性。免疫組化實驗結(jié)果與上述結(jié)果一致，在細胞中的分布情況為：p-eNOS和eNOS均僅在主動脈內(nèi)皮細胞胞漿中表達。提示SIRT1激活可顯著改善Klotho基因缺陷對主動脈中eNOS活性的抑制。③lucigenin化學發(fā)光實驗顯示，與 WT組相比，K

20、L+/-組小鼠主動脈中NADPH氧化酶活性顯著增加（P<0.05 vs WT+Saline），提示Klotho基因缺陷誘導了主動脈中NADPH氧化酶活化。經(jīng)SRT1720干預后， NADPH氧化酶活性明顯降低（P<0.05 vs KL+/-+Saline），與WT組無統(tǒng)計學差異。④DHE染色實驗顯示，KL+/-組小鼠主動脈中超氧化物含量較WT組顯著性增加（P<0.001 vs WT+Saline），提示Klotho基因缺陷誘導了主動脈中