丁香假單胞菌番茄致病變種和煙草致病變種egfp標記突變體的構建.pdf

1、植物病原細菌的三型分泌系統(tǒng)(TTSS)是丁香假單胞菌(Pseudomonaa syringae)侵染過程中重要的蛋白分泌系統(tǒng)。TTSS的編碼、蛋白分泌等受到hrp基因的調節(jié)。研究hrp基因在病菌侵染過程中的表達情況有助于進一步探索hrp基因的功能,揭示植物病原細菌的分子致病機制,而egfp標記突變體的構建是開展寄主.病原物的互作研究的重要策略。
　　 本試驗擬以增強型綠色熒光蛋白基因(egfp)作為報告基因,以植物丁香假單胞菌煙

2、草致病變種和番茄致病變種為材料,以其hrpA基因和hrpZ基因為靶標,通過體外重組和雙親結合技術,分別構建靶標基因與egfp融合表達的突變體,以及靶標基因缺失的egfp標記突變體,為今后研究丁香假單胞菌.植物的互作提供有用的材料工具。主要試驗結果為:
　　 (1)以丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000菌株和煙草致病變種4號菌株的基因組DNA為模板,擴增出hrpA、hrpZ基因及其上下游片段；以pEGFP-C1為模板擴增出了egf

3、p ORF全長。將相關的DNA片段進行體外重組后,得到了4個與預期大小一致的目的大片段CDE3、CTE1、CTE3、CTE4,它們分別為hrpZPto::egfp、hrpAPsta::egfp、hrpZPsta::egfp融合型片段和ΔhrpZPsta::egfp缺失型片段,為下一步構建融合型、缺失型突變體的構建奠定了基礎。
　　 (2)試驗將獲得的目的大片段CDE3、CTE1、CTE3、CTE4分別連接至克隆載體pMD19-T

4、,提取陽性克隆質粒pMD19-CDE3、pMD19-CTE1、pMD19-CTE3、pMD19-CTE4的DNA與自殺型質粒pKSM1的DNA同時進行BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切,切膠回收的酶切片段進行連接,得到了適于進行雙親接合所用的自殺型重組質粒pKSM-CDE3、pKSM—CTE1、pKSM-CTE3、pKSM—CTE4。
　　 (3)將含有質粒pKSM-CDE3的大腸桿菌S17-1與番茄致病變種DC3000野生型菌株進行雙

5、親接合后獲得了hrpZPto::egfp融合型突變體；將含有質粒pKSM-CTE1、pKSM-CTE3、pKSM-CTE4的大腸桿菌S17-1分別與煙草致病變種4號菌野生型菌株進行雙親結合獲得了hrpAPsta::egfp、hrpZPsta::egfp融合型突變體和ΔhrpZPsta::egfp缺失型突變體。將獲得的4個突變體菌株劃線于KB培養(yǎng)基(30μg/ml Nalr)上,在紫外燈下觀察發(fā)現(xiàn)hrpAPsta::egfp融合型突變體有

6、明顯的綠色熒光,而hrpZPto::egfp,hrpAPsta::egfp融合型突變體及△hrpZPsta::egfp缺失型突變體則無綠色熒光。
　　 (4)與野生型菌株相比,以上構建的4個egfp標記突變體人工接種煙草后,pv.tomatoDC3000的hrpZPto::egfp融合型突變體的過敏性誘導能力明顯降低；hrpAPsta::egfp,hrpZPsta::egfp融合型突變體及ΔhrpZPsta::egfp缺失型突變