東南景天內(nèi)生菌分離鑒定及其強化重金屬超積累效應(yīng)與機制.pdf

1、土壤重金屬污染是目前面臨的一個嚴重的環(huán)境問題，由于采礦、冶金、金屬制造業(yè)排污，農(nóng)業(yè)和城市生活廢物的填埋和污水灌溉，導(dǎo)致土壤重金屬污染日益嚴重。植物修復(fù)是一種新型的、價格低廉并且可持續(xù)發(fā)展的原位修復(fù)技術(shù)。重金屬超積累植物是修復(fù)重金屬污染土壤、底泥和水體資源的良好材料。然而，大多數(shù)重金屬超積累植物都存在生物量小、生長速度緩慢、根系不發(fā)達以及根際土壤重金屬生物有效性低等限制其大規(guī)模修復(fù)應(yīng)用的因素。為了提高植物修復(fù)效率，一些促進超積累植物生長及

2、強化根際重金屬生物有效性的策略也在逐漸引起大家的關(guān)注。
　　 超積累生態(tài)型東南景天(SedumalfrediiHance)是最初在浙江省衢州市古老PbZn礦址上發(fā)現(xiàn)的第一個中國原生的Zn/Cd超積累植物，也能積累Pb，不僅是研究植物吸收、轉(zhuǎn)運和超積累Zn/Cd機理的良好模式材料，也是提升植物修復(fù)重金屬污染技術(shù)的良好材料。盡管東南景天在生長速率和生物量上相比多數(shù)重金屬超積累植物要有些優(yōu)勢，但其修復(fù)土壤重金屬污染的效率還是受到生長慢

3、、生物量小、適應(yīng)性弱和土壤重金屬可及性的限制，研發(fā)促進東南景天生長和抗逆、提高東南景天生物量、提高東南景天對土壤重金屬可及性和吸收、轉(zhuǎn)運、積累重金屬能力的微生物強化技術(shù)對于發(fā)揮東南景天修復(fù)重金屬污染的潛能，提高實際應(yīng)用的效率至關(guān)重要。
　　 本研究主要研究結(jié)果如下:
　　 1.用以1-氨基環(huán)丙烷-1羧酸(ACC)為唯一氮源并添加Zn、Cd和/或Pb的多碳源無機鹽基本培養(yǎng)基，從超積累植物東南景天原生地的植株和根際土壤中分離

4、得到85個耐受重金屬的細菌菌株。對細菌16SrRNA基因(16SrDNA)序列的分析顯示所得細菌分別歸屬于變形菌門(55％)，放線菌門(27％)，厚壁菌門(11％)和擬桿菌門(7％)的20個屬，其中45個(53％)菌株可能分別代表8個屬的15-17個新種。從28個菌株中擴增得到ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因(acdS)的片段，其中21個菌株在自由培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出ACC脫氨酶活性，另7個不表現(xiàn)ACC脫氨酶活性的貪Cu菌屬菌株的acdS與其16SrD

5、NA序列在系統(tǒng)發(fā)育上不符，可能在進化過程中通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得了acdS。所有菌株都不同程度地耐受Zn、Cd和/或Pb。從根際土壤，根和地上部分離到的菌株中能耐受較高濃度Zn、Cd或Pb的比例往往與原生境中該金屬的濃度正相關(guān)，顯示出原生地土壤和植株中高濃度的重金屬對細菌耐受重金屬的選擇作用和與東南景天聯(lián)合細菌對生境中重金屬的適應(yīng)性。大多數(shù)菌株能產(chǎn)生吲哚乙酸，嗜鐵素或溶磷，有促進植物生長和提高土壤中重金屬可溶性的潛能。
　　 2.

6、研究了從東南景天體內(nèi)分離的伯克氏菌屬(Burkholderia)的SaZR4，SaMR10，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)的SaMR12和貪噬菌屬(Variovorax)的SaNR1四個菌株的內(nèi)生特性、在根部的定殖模式及其強化植物提取重金屬的能力。激光掃描共聚焦顯微鏡的觀測結(jié)果表明菌株SaZR4，SaMR12，和SaNR1具有在植物根部形成生物被膜(biofilm)的能力，SaZR4和SaMR12可以定殖在根內(nèi)部組織。SaM

7、R10在東南景天體內(nèi)定殖的總量是最低的，對東南景天生長和提取重金屬的促進作用也是最弱的。SaZR4顯著強化了東南景天對Zn的提取，但是對Cd的提取沒有顯著影響。SaMR12和SaNR1可以在含有Zn或Cd的基質(zhì)中顯著促進東南景天生長并提高了對Zn或Cd的提取。結(jié)果表明所用的四株特異內(nèi)生細菌能以不同的方式在植物體內(nèi)定殖、調(diào)控植物生長及提取和積累重金屬。SaMR12和SaNR1菌株具有強化東南景天修復(fù)Zn和Cd污染土壤的應(yīng)用潛力。
　

8、　 3.基于伯克氏菌屬的SaZR4，鞘氨醇單胞菌屬的SaMR12和貪噬菌屬的SaNR1能促進東南景天生長和吸收、轉(zhuǎn)運Zn和/或Cd的潛能，進一步用它們接種在兩種重金屬復(fù)合污染土壤上生長的東南景天，檢驗了內(nèi)生細菌對東南景天修復(fù)重金屬復(fù)合污染土壤的作用;基于東南景天的多年生特性，采用兩季收獲地上部和多次接種，檢驗了內(nèi)生細菌應(yīng)用于強化多年生超積累植物連續(xù)提取重金屬的可行性。結(jié)果表明接種內(nèi)生細菌可以連續(xù)兩季顯著提高在兩種重金屬復(fù)合污染土壤上生

9、長的東南景天地上部的生物量，提高東南景天對Zn和Cd的提取量，而且提高最后所收獲根部的生物量，提高了植物對Pb和Cu的提取量，證實了連續(xù)接種內(nèi)生細菌結(jié)合多季收獲東南景天修復(fù)重金屬復(fù)合污染土壤的可行性。
　　 4.SaCS12是從在礦山原生境健康生長的東南景天體內(nèi)分離到的一株耐受多種重金屬并可以用人工培養(yǎng)基純培養(yǎng)的真菌。根據(jù)菌落形態(tài)、孢子形態(tài)和分子鑒定初步將其確定為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。致病性檢測結(jié)果表

10、明SaCS12對易發(fā)生枯萎病和根腐病的農(nóng)作物沒有致病性。通過溶液培養(yǎng)與土培盆栽試驗研究了該真菌對東南景天的生長和吸收積累重金屬的影響。水培結(jié)果表明SaCS12可以增加根長和表面積、促進側(cè)根發(fā)育，促進了植物對營養(yǎng)元素的吸收和葉綠素的合成。顯微觀察結(jié)果表明SaCS12促進了東南景天根毛的發(fā)育，擴大了根毛區(qū)在根系中的比例。SaCS12可以促進東南景天在礦山土和水稻土兩種原始重金屬復(fù)合污染土壤上的生長，能夠強化東南景天對土壤中重金屬的活化，增加

11、了植物對重金屬的吸收及轉(zhuǎn)運。和不接種對照相比，接種植物對Zn、Cd、Pb和Cu的植物修復(fù)效率在礦山土上分別增加了144、139、84和63％，在水稻土上分別增加了44、55、85和77％。研究發(fā)現(xiàn)了一種可培養(yǎng)真菌而非菌根真菌強化超積累植物修復(fù)重金屬污染土壤的作用，發(fā)現(xiàn)了非致病尖孢鐮刀菌在植物修復(fù)重金屬中的應(yīng)用潛力。
　　 5.采用水培實驗系統(tǒng)比較了內(nèi)生真菌印度梨形孢(Piriformosporaindica)對兩種生態(tài)型東南景天

12、生長、根系形態(tài)、營養(yǎng)元素吸收及重金屬吸收與轉(zhuǎn)運的影響。在Zn或Cd處理下，超積累生態(tài)型比非超積累生態(tài)型具有更好的耐性以及吸收與轉(zhuǎn)運重金屬的能力。印度梨形孢能夠在兩種生態(tài)型東南景天根部定殖，促進兩種生態(tài)型植物根系的生長發(fā)育，提高了植物體內(nèi)氮和磷含量，促進了植物生長。印度梨形孢可以提高兩種生態(tài)型東南景天對Zn和Cd的耐性，但是對二者在吸收和轉(zhuǎn)運重金屬方面卻有不同的調(diào)控作用。印度梨形孢可以提高超積累生態(tài)型對Zn和Cd的吸收及轉(zhuǎn)運，提高Zn和C

13、d在植物地上部的積累，地上部Zn和Cd積累量分別是不接種對照的1.17-1.75倍和1.83-2.21倍。而對非超積累生態(tài)型，在200μMZn或10μMCd處理水平下，非超積累生態(tài)型已經(jīng)表現(xiàn)出了重金屬毒害癥狀。印度梨形孢可以通過降低非超積累生態(tài)型對Zn或Cd的吸收在一定程度上緩解重金屬的毒害作用。研究表明印度梨形孢能強化超積累植物提取和積累重金屬，在植物修復(fù)重金屬污染中發(fā)揮作用，也能幫助非金屬積累植物耐受重金屬。研究發(fā)現(xiàn)與東南景天在原生