基于混合菌群的水稻秸稈丁酸發(fā)酵過程優(yōu)化與機制研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的儲量巨大，以其為原料的生物基產(chǎn)品及其生產(chǎn)技術(shù)對于化工產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展、能源安全保障和環(huán)境保護均具有重要意義，發(fā)展前景廣闊。在木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化過程中，其水解糖化是關(guān)鍵技術(shù)之一，目前最為有效的方法是酶解。然而，高昂的酶制劑極大地限制了以木質(zhì)纖維素為原料的生物基產(chǎn)品生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展。而基于混合菌群的發(fā)酵，無需使用昂貴的纖維素酶就能將木質(zhì)纖維素原料轉(zhuǎn)化為各種化學(xué)品。丁酸被廣泛應(yīng)用于化工、食品飲料和制藥等行業(yè)，還可進一步轉(zhuǎn)化為

2、生物燃料丁醇，是一種高附加值的生物基產(chǎn)品，但其生物轉(zhuǎn)化的商品化進程受到酶解糖化成本高、發(fā)酵副產(chǎn)物多及產(chǎn)率低等問題的嚴(yán)重制約。本文以開發(fā)避免使用纖維素酶試劑的基于混合菌群的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)丁酸發(fā)酵技術(shù)為目標(biāo)，進行了水稻秸稈的預(yù)處理、丁酸發(fā)酵混合菌群的選育、丁酸發(fā)酵系統(tǒng)的構(gòu)建及效能調(diào)控等研究，并從微生物學(xué)、生理生態(tài)學(xué)和代謝調(diào)控等方面探討了混合菌群發(fā)酵秸稈產(chǎn)丁酸的機理。
　　研究采用堿對水稻秸稈進行預(yù)處理，在50℃條件下，經(jīng)1％氫氧化鈉

3、溶液浸泡72 h，木質(zhì)素去除率可達66%左右，而84%的纖維素和71%的半纖維素得到保留。同時，以牛糞、豬糞堆肥、玉米地土壤和腐木等為出發(fā)菌群，經(jīng)過8個月的傳代富集與篩選，獲得一個具有穩(wěn)定的纖維素、半纖維素利用能力和高丁酸產(chǎn)率的混合菌群，其微生物組成以纖維素降解菌、木聚糖降解菌、丁酸發(fā)酵菌以及其他產(chǎn)酸發(fā)酵菌為主。該菌群以氫氧化鈉預(yù)處理水稻秸稈為底物，獲得了6g/L的丁酸產(chǎn)量，占總揮發(fā)性脂肪酸的76%，與理論上丁酸梭菌（Clostridi

4、um butyricum）和酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）發(fā)酵葡萄糖的丁酸比例相當(dāng)，表明該菌群在發(fā)酵水稻秸稈產(chǎn)丁酸方面具有很好的潛力。
　　為了提高所選育的混合菌群發(fā)酵水稻秸稈的產(chǎn)丁酸能力，對pH值與緩沖劑、產(chǎn)甲烷抑制劑以及發(fā)酵模式進行了研究。結(jié)果表明，采用CaCO3與NaHCO3組合作為緩沖劑將發(fā)酵系統(tǒng)pH值控制于6.0～6.5之間對于丁酸發(fā)酵最為適宜，可獲得7.3 g/L的丁酸產(chǎn)量。在發(fā)酵系統(tǒng)

5、中加入0.08 g/L的氯仿可完全避免產(chǎn)甲烷的發(fā)生，且不會對系統(tǒng)丁酸發(fā)酵能力產(chǎn)生不利影響。在各種發(fā)酵模式中，重復(fù)分批發(fā)酵模式會使系統(tǒng)中的副產(chǎn)物增加，而目標(biāo)產(chǎn)物丁酸的產(chǎn)率逐批下降，不適于混合菌群的丁酸發(fā)酵。相對于分批發(fā)酵，補料分批發(fā)酵在提高發(fā)酵液丁酸濃度方面更具優(yōu)勢。通過排發(fā)酵液再補料的發(fā)酵方式，可以緩解產(chǎn)物和鈉離子的抑制作用以及發(fā)酵菌種的老化。
　　補料分批發(fā)酵模式下，在有效容積為20 L的攪拌槽式反應(yīng)系統(tǒng)中，混合菌群表現(xiàn)出了較強

6、的發(fā)酵秸稈產(chǎn)酸能力?？刂瓢l(fā)酵系統(tǒng)pH于6.0～6.5，每天排料3L后補料3 L（90 g/L的預(yù)處理秸稈），總揮發(fā)酸和丁酸產(chǎn)量可分別達到28.5和16.1 g/L，甚至高于許多已報道的純菌種發(fā)酵葡萄糖或蔗糖時的產(chǎn)量。其中，秸稈的丁酸轉(zhuǎn)化率可達理論值的35%，總揮發(fā)酸實際產(chǎn)率（以乙酸當(dāng)量計）更是高達理論值的64%。PCR-DGGE分析表明，混合菌群在補料分批發(fā)酵過程中保持了群落構(gòu)成的相對穩(wěn)定，纖維素和半纖維素降解菌、氨基酸降解菌、丁酸發(fā)酵

7、菌及其他產(chǎn)酸發(fā)酵菌的共同作用和相互制約機制，為秸稈發(fā)酵產(chǎn)丁酸的高效性奠定了微生物基礎(chǔ)。
　　分析認為，所選育混合菌群可通過以下兩個機制獲得較高的丁酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量：
　?。?）混合菌群在秸稈發(fā)酵過程中，可通過丁酸發(fā)酵與乙酸發(fā)酵的平衡調(diào)節(jié)機制提高丁酸的產(chǎn)率。在發(fā)酵初期，混合菌群主要產(chǎn)生乙酸以獲得更多的ATP用于微生物生長。隨著乙酸生成的增加，NADH+H+過剩，發(fā)酵系統(tǒng)的pH下降，發(fā)酵液中的乙酸被細胞重新吸收并轉(zhuǎn)化成丁酸。同時，

8、乙酸發(fā)酵受到限制，而丁酸發(fā)酵則得到加強，從而減少了酸性末端和NADH+H+的形成。如此，通過乙酸發(fā)酵和丁酸發(fā)酵的平衡調(diào)節(jié)，使得發(fā)酵系統(tǒng)能夠達到生理生態(tài)上的平衡，并保證了較高的丁酸產(chǎn)率。
　　（2）在混合菌群產(chǎn)酸發(fā)酵系統(tǒng)中，混合菌群可通過初級發(fā)酵途徑和次級發(fā)酵途徑產(chǎn)生丁酸，是混合菌群高效發(fā)酵秸稈產(chǎn)丁酸的另一個機制。在初級發(fā)酵中，細菌轉(zhuǎn)化單糖或纖維素生成丁酸；在次級發(fā)酵中，細菌利用乙酸或乙醇通過加鏈反應(yīng)生成丁酸，也可通過乳酸的氧化生成