海島棉顯性無腺體基因Gl2e的圖位克隆和功能驗(yàn)證.pdf

1、除了棉纖維，棉籽是棉花加工中的主要副產(chǎn)品，富含大量的蛋白質(zhì)和脂肪。然而，棉酚及其衍生物沉積在腺體中使棉籽對人和單胃動物等非反芻動物有毒性，棉酚含量僅0.15％～0.20％就可產(chǎn)生很嚴(yán)重的中毒現(xiàn)象，致使?fàn)I養(yǎng)豐富的棉籽不能被直接食用。棉酚是一種貯存于棉花色素腺體中的倍半萜烯類化合物，在根尖培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)棉酚主要在根部合成，然后運(yùn)輸?shù)较袤w內(nèi)積累。棉酚也是植株自身防御病蟲危害的重要組成部分，若植株部位缺少棉酚會導(dǎo)致棉花病蟲的危害而影響產(chǎn)量。遺傳

2、分析表明Gl2e基因是控制腺體有無的顯性基因，為Gl2和Gl3的復(fù)等位基因，并對Gl2和Gl3顯性上位，在Gl2e基因的存在下能夠消除棉花植株部分和種子的所有腺體，并導(dǎo)致低棉酚含量。
　　在本研究中構(gòu)建了[（TM-1×海1），(TM-1×N1)，(TM-1×N7)]三個海陸F2群體，共2197個單株，利用361對SSR引物將Gl2e定位在分子標(biāo)記w5383和w7954之間。Gl2e與w5383和w7954的距離分別為0.5cM和0

3、.6cM。根據(jù)遺傳定位結(jié)果，對候選區(qū)段內(nèi)7個候選基因的進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果顯示ORF2在有腺體材料和無腺體葉片之間存在顯著的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異。該基因編碼一個全長1428bp的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，無內(nèi)含子。在有腺體材料和無腺體材料之間存在3個SNPs，導(dǎo)致一個氨基酸的差異。根據(jù)此基因的SNPs設(shè)計(jì)引物重新進(jìn)行遺傳定位，引物與表型之間緊密連鎖，并無分離單株，確定該基因就是控制腺體形成的關(guān)鍵基因。在單節(jié)顯性腺體材料中，gl2和gl3基因中均發(fā)生了

4、堿基插入，導(dǎo)致提前終止。利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virusinduced gene silencing，VIGS)技術(shù)驗(yàn)證Gl2e的功能。Gl2e基因沉默后，表達(dá)量下降、腺體形成受到明顯抑制，新生葉片和莖桿腺體逐漸減少，葉片中半棉酚和棉酚含量顯著下降。在有腺體材料TM-1中Gl2e基因被沉默和未沉默的葉片轉(zhuǎn)錄組比較分析結(jié)果顯示，4293個基因在正常葉片和Gl2e干擾葉片中差異表達(dá)，其中2276個基因在干擾后上調(diào)表達(dá)，1306個基因下調(diào)表

5、達(dá)。上調(diào)表達(dá)的基因主要富集在光反應(yīng)、細(xì)胞壁降解、蛋白質(zhì)合成;下調(diào)表達(dá)基因顯著富集在次生代謝、茉莉酸信號和WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族。棉酚生物合成途徑中的重要基因如TPSs家族在干擾葉片中顯著下調(diào)表達(dá)，表明腺體與棉酚生物合成之間存在密切分子聯(lián)系。
　　色素腺體是棉酚及其衍生物的主要存儲器官，腺體的有無、密度與棉酚含量密切相關(guān)。本研究通過圖位克隆成功獲得了一個控制腺體的關(guān)鍵基因Gl2e，為棉花等多倍體材料的圖位克隆提供寶貴經(jīng)驗(yàn)。也將幫助我們