Tfcp211促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新的相互作用蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)可以在體外進(jìn)行自我復(fù)制式的增殖（自我更新），并且同時(shí)保持著能夠分化成有機(jī)體各種類(lèi)型細(xì)胞的能力，因此胚胎干細(xì)胞ESCs在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有著廣泛的應(yīng)用前景。前期的實(shí)驗(yàn)我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子Tfcp2l1(Transcription factor CP2-like1，Tfcp2l1)是LIF/STAT3信號(hào)通路的關(guān)鍵下游的靶基因，Tfcp2l1表達(dá)水平的變化能夠大大地影響LIF/

2、STAT3信號(hào)通路促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse ESCs，mESCs)自我更新的功能，但是Tfcp2l1作用的具體分子機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。是否存在對(duì)于mESCs自我更新至關(guān)重要的、全新的轉(zhuǎn)錄因子。截至目前，在眾多已揭示的STAT3(signal transducerand activator of transcription3)下游靶基因中，只有下調(diào)Tfcp2l1的表達(dá)，才可以削弱STAT3信號(hào)促進(jìn)mESCs自我更新的功能，從而誘導(dǎo)細(xì)

3、胞分化，而至今鑒定出能夠誘導(dǎo)mESCs分化的基因并不多。基于Tfcp2l1對(duì)mESCs自我更新的重要作用，結(jié)合本課題組多種高效的基因編輯工具，如慢病毒表達(dá)系統(tǒng)和PiggyBacTransposon系統(tǒng)等，有可能發(fā)現(xiàn)新的，并且對(duì)于維持mESCs未分化狀態(tài)至關(guān)重要的基因。本課題通過(guò)初步篩選，發(fā)現(xiàn)MTA家族（包括MTA1，MTA2，MTA3）中MTA1和Tfcp2l1具有相互作用，其表達(dá)量的變化能夠大大影響Tfcp2l1促進(jìn)mESCs的自我更

4、新能力。本課題具體的實(shí)驗(yàn)方案流程如下:
　　首先是46C mESCs的培養(yǎng)，本課題所使用的46C mESCs，由劍橋大學(xué)Wellcome Truet Center研究所Austin Smith教授饋贈(zèng)。46C mESCs培養(yǎng)在含有明膠包被的培養(yǎng)板里，培養(yǎng)基主要成分含有10％的胎牛血清和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)，當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)至70％左右時(shí)，用胰酶進(jìn)行消化。其次我們構(gòu)建過(guò)表達(dá)Tfc

5、p2l1的46C mESCs，主要分為以下幾個(gè)過(guò)程:首先構(gòu)建PB-Tfcp2l1載體:設(shè)計(jì)Tfcp2l1引物、獲取目的基因Tfcp2l1、目的基因與PB-Tfcp2l1質(zhì)粒的連接。構(gòu)建好的載體即重組PB-Tfcp2l1空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆后擴(kuò)大培養(yǎng)再抽提PB-Tfcp2l1質(zhì)粒。得到PB-Tfcp2l1重組質(zhì)粒的測(cè)序正確的，再使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法把PB-Tfcp2l1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染46CmESCs，此時(shí)過(guò)表達(dá)Tfcp2

6、l1的46C mESCs構(gòu)建完成，接著我們利用堿性磷酸酶(AP)染色和蛋白免疫印跡(Western Blot)方法鑒定Tfcp2l1轉(zhuǎn)入46CmESCs的過(guò)表達(dá)情況。過(guò)表達(dá)Tfcp2l1的46C mESCs構(gòu)建成功后，我們?cè)偬暨x過(guò)表達(dá)PB-Tfcp2l1的46C mESCs的單克隆細(xì)胞株，然后鑒定過(guò)表達(dá)PB-Tfcp2l1的46CmESCs單克隆細(xì)胞株在無(wú)LIF條件下的自我更新能力，使用的檢測(cè)方法為AP染色和qRT-PCR。
　　

7、為了尋找Tfcp2l1促進(jìn)46C mESCs自我更新的潛在相互作用蛋白，我們參照了Debbie L.C在期刊cell stem cell上面報(bào)道的關(guān)于Tfcp2l1蛋白免疫共沉淀的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。我們首先選取MTA1，MTA2，MTA3三者作為我們的候選基因來(lái)研究其是否與Tfcp2l1存在相互作用來(lái)促進(jìn)46C mESCs自我更新。首先我們使用RNA干擾技術(shù)來(lái)對(duì)MTA1，MTA2，MTA3三者的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，即下調(diào)MTA1，MTA2，M

8、TA在46C mESCs中的表達(dá)，來(lái)看其是否影響46C mESCs自我更新能力。此時(shí)使用的46C mESCs均是Tfcp2l1過(guò)表達(dá)的46C mESCs單克隆細(xì)胞株。我們構(gòu)建了MTA1，MTA2，MTA3的shRNA慢病毒載體:即針對(duì)Mta1、Mta2、Mta3三個(gè)基因設(shè)計(jì)RNA干擾引物，并重新連接至Plko.1-shRNA慢病毒載體。重組后的質(zhì)粒Plko.1再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行重組質(zhì)粒Plko.1-shRNA

9、質(zhì)粒抽提，測(cè)序鑒定正確的Plko.1-shRNA質(zhì)粒用于下一步的病毒包裝。病毒的包裝使用Plko.1-shRNA質(zhì)粒，包裝細(xì)胞使用293FT細(xì)胞（其培養(yǎng)基的主要成分含有10％的胎牛血清）。轉(zhuǎn)染使用的是lipofection LTX脂質(zhì)體。病毒收取后感染Tfcp2l1過(guò)表達(dá)的46C mESCs。之后再使用AP染色和qRT-PCR鑒定Tfcp2l1過(guò)表達(dá)的46C mESCs的自我更新能力。最后使用免疫共沉淀技術(shù)鑒定Tfcp2l1和MTA1在

10、mESCs中的相互作用。
　　整個(gè)實(shí)驗(yàn)方案流程如上文所述，其主體分為兩大部分，第一部分是Tfcp2l1基因過(guò)表達(dá)46C mESCs的構(gòu)建，第二部分是在過(guò)表達(dá)Tfcp2l1的46C mESCs中降低MTA1，MTA2，MTA3的表達(dá)以檢測(cè)它們是否可以影響mESCs的自我更新。我們發(fā)現(xiàn)只有在于擾MTA1的表達(dá)條件下，過(guò)表達(dá)Tfcp2l1的mESCs分化情況明顯，即其自我更新能力下降了。qRT-PCR鑒定的結(jié)果如下:在干擾MTA1的表達(dá)

11、的PB-Tfcp2l1的46C mESCs中，mESCs相關(guān)自我更新基因Nanog、 Esrrb和Rex1的表達(dá)量下調(diào)，說(shuō)明了干擾MTA1的表達(dá)后減弱了Tfcp2l1促進(jìn)mESCs自我更新能力。相反的，mESCs相關(guān)的分化基因Gata6和sox17的表達(dá)量上升很多，說(shuō)明了干擾MTA1的表達(dá)誘導(dǎo)了mESCs的分化。綜合以上分析，干擾MTA1的表達(dá)可以影響Tfcp2l1促進(jìn)mESCs自我更新能力。而免疫共沉淀的結(jié)果顯示Tfcp2l1和MTA