microRNA-7-5p通過(guò)mTORC2-SGK-1信號(hào)通路調(diào)控人肺泡上皮細(xì)胞鈉離子通道作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：目前認(rèn)為，通過(guò)上調(diào)肺泡上皮鈉離子通道（ENaC）的表達(dá)可以增加Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)，為肺泡液體清除（alveolar fluid clearance，AFC）提供驅(qū)動(dòng)力，減輕肺水腫，從而使急性呼吸窘迫綜合癥（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的患者受益?，F(xiàn)已闡明，ENaC主要受mTORC2/SGK-1信號(hào)通路的調(diào)控。MicroRNA(miRNA)是非編碼微小RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其

2、目的mRNA的翻譯過(guò)程。已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-7-5p參與了腫瘤細(xì)胞中mTOR的調(diào)控，但是在人肺泡上皮細(xì)胞中miRNA-7-5p調(diào)控ENaC的機(jī)制并不清楚，其能否在ARDS時(shí)影響ENaC的表達(dá)水平亦未見(jiàn)有報(bào)道。
　　目的：探討miRNA-7-5p通過(guò)mTORC2/SGK-1信號(hào)通路對(duì)人肺泡上皮鈉離子通道的調(diào)控機(jī)制。再進(jìn)一步揭示急性呼吸窘迫綜合癥時(shí)人肺泡上皮 miRNA-7-5p的表達(dá)變化與其在肺泡液體清除過(guò)程中起到的作用。由此

3、豐富 ARDS發(fā)病機(jī)制的分子生物學(xué)理論，并為該疾病的臨床治療提供新的線索。
　　方法：
　　本研究由三部分組成
　　第一部分：雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miRNA-7-5p靶基因
　　首先通過(guò)重組DNA質(zhì)粒構(gòu)建psiCHECK2-mTOR、psiCHECK2-mTOR-mut、psiCHECK2-SGK-1、psiCHECK2-SGK-1-mut共四組mRNA3’-UTR中含有或不含miRNA-7-5p靶序列的重

4、組報(bào)告基因。然后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分別證實(shí)mTOR、SGK-1是否均為miRNA-7-5p的靶基因。
　　第二部分：miRNA-7-5p調(diào)控人肺泡上皮細(xì)胞ENaC的機(jī)制研究
　　轉(zhuǎn)染miRNA-7-5p mimic上調(diào)肺泡上皮miRNA-7-5p表達(dá)水平后，qRT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組 miRNA-7-5p、mTOR mRNA、SKG-1 mRNA表達(dá)水平，了解miRNA-7-5p對(duì) mTOR mRNA、SKG-1 m

5、RNA的靶作用。再應(yīng)用免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)各組mTOR、Total AKT、p-AKT-ser473、SGK-1表達(dá)水平，探索 miRNA-7-5p對(duì) mTORC2/SGK-1信號(hào)通路活性的調(diào)控作用。最后驗(yàn)證miRNA-7-5p對(duì)ENaC各亞基表達(dá)水平的影響。
　　第三部分：miRNA-7-5p對(duì)LPS誘導(dǎo)下人肺泡上皮細(xì)胞ENaC的調(diào)控機(jī)制研究
　　使用LPS刺激A549細(xì)胞以模擬ARDS時(shí)的病

6、理狀況，分別在0，3，6，12，24小時(shí)利用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miRNA-7-5p的變化情況。使用LPS刺激12小時(shí)后，轉(zhuǎn)染miRNA-7-5p inhibitor下調(diào)miRNA-7-5p表達(dá)，再通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)mTOR與SGK-1的mRNA表達(dá)水平，免疫印跡法檢測(cè)各組mTOR、Total AKT、p-AKT-ser473、SGK-1表達(dá)水平，探討抑制 miRNA-7-5p的表達(dá)在 ARDS時(shí)對(duì)mTORC2/SGK-1信號(hào)通

7、路活性的調(diào)控作用。最后繼續(xù)應(yīng)用免疫印跡法、免疫熒光顯微鏡檢測(cè)miRNA-7-5p對(duì)LPS誘導(dǎo)下ENaC-α、β、γ三個(gè)亞基與mTOR、SGK-1的表達(dá)影響。
　　結(jié)果：
　　1.雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miRNA-7-5p靶基因
　　通過(guò)TargetScan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)mTOR與SGK-1的3’-UTR內(nèi)都有miRNA-7-5p的靶點(diǎn)序列。分別構(gòu)建mTOR與SGK-1 mRNA3’-UTR中含有miRNA-7-5p靶序列

8、的野生型和突變型報(bào)告基因載體，與miRNA-7-5p mimic或miRNA-7-5p negative control共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miRNA-7-5p對(duì)于psiCHECK-2-mTOR的熒光表達(dá)有非常顯著的抑制作用，相對(duì)熒光強(qiáng)度下降至57%±5%(7.11±0.64與12.50±0.99)，與陰性對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而miRNA-7-5p對(duì)psiCHECK-2-mTOR

9、-mut的熒光表達(dá)沒(méi)有明顯抑制作用(P＞0.05)。我們還發(fā)現(xiàn)在建立的雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)中，miRNA-7-5p對(duì)于psiCHECK-2-SGK-1的熒光表達(dá)也具有非常顯著的抑制作用，相對(duì)熒光強(qiáng)度下降至45%±4%(5.12±0.46與11.49±1.48)，與陰性對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；但是miRNA-7-5p對(duì)psiCHECK-2-SGK-1-mut的熒光表達(dá)則沒(méi)有明顯抑制作用(P＞0.05)。
　　

10、2. miRNA-7-5p調(diào)控人肺泡上皮細(xì)胞ENaC的機(jī)制研究
　　A549細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miRNA-7-5p mimic與negative control后，通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，miRNA-7-5p mimic轉(zhuǎn)染組中mTOR的mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組和negative control組出現(xiàn)了明顯的降低，其表達(dá)水平僅為空白對(duì)照組的0.54倍（P＜0.01）；SGK-1的mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組和negative

11、 control組也出現(xiàn)了明顯的降低，其表達(dá)水平低至空白對(duì)照組的0.30倍（P＜0.01）。接下來(lái)通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，mTOR與 SGK-1的蛋白表達(dá)同樣出現(xiàn)了降低(P＜0.01)，同時(shí)，mTORC2下游磷酸化產(chǎn)物 p-Akt-Ser473的表達(dá)降低(P＜0.01)。這些結(jié)果表明，miRNA-7-5p能夠在細(xì)胞內(nèi)抑制 mTORC2/SGK-1信號(hào)通路的活性。然后應(yīng)用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miRNA-7-5p

12、mimic轉(zhuǎn)染組ENaC-α、β、γ三個(gè)亞基的表達(dá)較空白組均出現(xiàn)了降低(P＜0.01)，這提示 miRNA-7-5p在肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)能夠通過(guò)mTORC2/SGK-1信號(hào)通路夠抑制ENaC的表達(dá)。
　　3.miRNA-7-5p對(duì)LPS誘導(dǎo)下人肺泡上皮細(xì)胞ENaC的調(diào)控機(jī)制研究
　　發(fā)現(xiàn)自100 ng/ml濃度LPS誘導(dǎo)后6小時(shí)開(kāi)始miRNA-7-5p的表達(dá)就開(kāi)始升高（P＜0.05），且隨時(shí)間推移，其表達(dá)呈逐漸上升的改變，分別為

13、LPS誘導(dǎo)開(kāi)始時(shí)的1.4、1.9與2.8倍（P＜0.05）。這說(shuō)明ARDS時(shí)，肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)miRNA-7-5p的表達(dá)有明顯升高。向LPS刺激后的A549細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miRNA-7-5p inhibitor與negative control，發(fā)現(xiàn)mTOR與SGK-1的mRNA表達(dá)水平較LPS組與LPS+negative control組均出現(xiàn)了明顯的回升(P＜0.01)。Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，mTOR，SGK-1與 p-Ak

14、t-Ser473的蛋白表達(dá)也分別出現(xiàn)了升高(P＜0.01)。這些結(jié)果表明，降低miRNA-7-5p的表達(dá)能夠在ARDS時(shí)恢復(fù)mTORC2/SGK-1信號(hào)通路的活性。同時(shí)Western blot實(shí)驗(yàn)與免疫熒光顯微鏡成像都證明ENaC亞基表達(dá)水平較單純LPS組均出現(xiàn)了明顯的恢復(fù)(P＜0.01)。這提示通過(guò)降低肺泡上皮細(xì)胞miRNA-7-5p的表達(dá)能夠提高ENaC的穩(wěn)定性，逆轉(zhuǎn)ARDS時(shí)低下的ENaC表達(dá)，從而可能起到增強(qiáng)肺水清除的效果。