GVHD致肺纖維化作用的機(jī)理研究.pdf

1、研究目的:
　　本研究通過構(gòu)建aGVHD肺損傷動(dòng)物模型，探討alIo-HSCT后aGVHD肺損傷肺組織內(nèi)微環(huán)境改變對(duì)肺上皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響和分子機(jī)理，闡明aGVHD肺損傷中是否存在EMT，并揭示其調(diào)控機(jī)制，為治療alIo-HSCT后aGVHD肺損傷和預(yù)防其遷延為肺纖維化尋找有效的靶標(biāo)提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　1)aGVHD肺損傷模型的構(gòu)建:以BALB/C小鼠作為受鼠，經(jīng)TBI8.0Gy全身放療預(yù)處理后接受

2、C57BL/6供鼠1O×106脾細(xì)胞+5×106骨髓細(xì)胞輸注誘導(dǎo)aGVHD肺損傷模型，單純接受供鼠5×106骨髓細(xì)胞輸注作為對(duì)照組，移植后隔日觀察移植受鼠生存狀況和GVHD臨床表現(xiàn)及嚴(yán)重程度，采集小鼠外周血檢測(cè)嵌合植入情況，同時(shí)留取aGVHD組和對(duì)照組小鼠肺組織標(biāo)本進(jìn)行HE和Masson染色觀察肺組織病理結(jié)構(gòu)變化及纖維膠原沉積情況，闡明aGVHD肺組織中是否存在纖維化現(xiàn)象。
　　2)血液、肺泡灌洗液及肺組織中T淋巴細(xì)胞亞群分析:采

3、用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組小鼠移植后不同時(shí)機(jī)(7d，14d，21d，28d)血液、肺泡灌洗液及肺組織中CD4、CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞亞群變化情況，探討不同淋巴細(xì)胞亞群分布在GVHD肺損傷發(fā)生發(fā)展過程中的作用。
　　3)血液、肺泡灌洗液及肺組織中細(xì)胞因子的表達(dá)水平檢測(cè):采用ELISA檢測(cè)移植后不同時(shí)機(jī)(7d，14d，21d，28d)血液和肺泡灌洗液中細(xì)胞因子(TGF-β，IFN-γ，TNF-α)的表達(dá)水平;同時(shí)采用RT-PCR檢測(cè)兩組肺組織

4、細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平;比較aGVHD肺損傷小鼠和對(duì)照組小鼠移植后不同時(shí)機(jī)血液、肺泡灌洗液及肺組織中細(xì)胞因子表達(dá)差異，探討細(xì)胞因子在時(shí)間和空間的差異表達(dá)對(duì)GVHD肺損傷致肺纖維化發(fā)生發(fā)展的影響。
　　4)EMT信號(hào)通路調(diào)控的研究:采用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)觀察移植后發(fā)生GVHD肺損傷患者肺組織標(biāo)本上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白(E-cadherin)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白(Vimentin)共表達(dá)情況;進(jìn)一步采用RT-PCR和Western blott

5、ing檢測(cè)GVHD組和對(duì)照組小鼠移植后不同時(shí)機(jī)肺組織中E-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白水平表達(dá)差異，并同時(shí)檢測(cè)EMT信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白分子Claudin-1、β-catenin以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Slug的表達(dá)差異情況，闡明在GVHD肺損傷中是否存在EMT，并探討其發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。
　　5)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s）描述，兩組均數(shù)的比較采用獨(dú)立

6、樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以p＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用log-rank方法，以p＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用GraphPad Prism5軟件作圖。
　　研究結(jié)果：
　　1)成功構(gòu)建C57BL/6→BALB/C aGVHD肺損傷動(dòng)物模型。分別于移植后第14天、21天、28天采集BALB/C受鼠外周血進(jìn)行C57BL/6供者標(biāo)志H2Kb檢測(cè)，結(jié)果顯示在移植后第28

7、天兩組小鼠的供者標(biāo)志H2Kb均可達(dá)到98％以上，提示供者植入成功。GVHD組小鼠出現(xiàn)明顯弓背、活動(dòng)度減低、毛發(fā)紋理紊亂、皮膚裸露及嚴(yán)重腹瀉等典型aGVHD表現(xiàn)，且與BMT對(duì)照組相比生存狀態(tài)具有顯著性差異(x2=32.514，P＜0.001)，aGVHD組小鼠移植后體重下降迅速，臨床評(píng)分高于BMT組小鼠。aGVHD小鼠肺組織病理顯示肺組織內(nèi)彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡上皮水腫、增生，肺泡間隔增厚等表現(xiàn)，Masson染色可見明顯膠原沉積，這些結(jié)

8、果提示移植后發(fā)生aGVHD的小鼠可出現(xiàn)彌漫性肺損傷改變，且肺組織內(nèi)存在纖維化現(xiàn)象。
　　2) GVHD肺損傷小鼠在移植早期以CD4+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主，到移植后期轉(zhuǎn)變?yōu)橐訡D8+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主。GVHD組小鼠血液中CD4+淋巴細(xì)胞在移植后第7d、第14d顯著升高(P＜0.05)，后逐漸下降;而兩組小鼠血液中CD8+淋巴細(xì)胞在移植后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。GVHD組小鼠肺泡灌洗液CD4+淋巴細(xì)胞在移植后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均

9、顯著升高(P＜0.05)，在移植后第7d達(dá)到高峰，后逐漸下降;而CD8+淋巴細(xì)胞從第14d開始明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，并隨移植時(shí)間逐漸升高至第28d達(dá)到高峰。GVHD組小鼠肺組織內(nèi)CD4+淋巴細(xì)胞在移植后第7d、第14d、第21d顯著高于BMT對(duì)照組(P＜0.05)，但從移植后第7d起呈逐漸下降趨勢(shì);而CD8+淋巴細(xì)胞在移植后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。
　　3)GVHD小鼠血液、肺泡灌洗液和肺組織中細(xì)胞因

10、子(IFN-γ、TNF-α和TGF-β)出現(xiàn)差異性表達(dá)。GVHD組小鼠血液中IFN-γ表達(dá)水平在移植第28d顯著低于BMT對(duì)照組(P＜0.05);TNF-α表達(dá)水平在移植后第7d、第14d、第21d顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，但從移植后第7d起呈逐漸下降趨勢(shì);兩組小鼠移植后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血液TGF-β表達(dá)水平均無顯著性差異(P＞0.05)。GVHD組小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ表達(dá)水平在移植后第7d、第14d顯著升高（P＜0.05），隨后

11、逐漸下降;移植后GVHD小鼠肺泡灌洗液中TNF-α表達(dá)水平逐漸升高，在移植第14d達(dá)高峰，后逐漸降低;TGF-β水平呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，在移植后第14d、21d、28d顯著高于BMT對(duì)照組（P＜0.05）。GVHD組小鼠肺組織中IFN-γ表達(dá)水平在移植后第7d、第14d明顯升高(P＜0.05)，而在移植后第28d反而低于對(duì)照組（P＜0.05）;TNF-α表達(dá)水平在移植后第7d升高，后逐漸降低，在移植后第21d、28d明顯低于對(duì)照組（P＜0

12、.05）;GVHD組小鼠肺組織內(nèi)TGF-β表達(dá)水平與肺泡灌洗液中的變化趨勢(shì)一致，在移植后第14d、21d、28d顯著高于BMT對(duì)照組(P＜0.05)。
　　4)GVHD肺損傷組織中存在EMT。我們觀察到移植后發(fā)生GVHD肺損傷患者肺組織中可見E-Cadherin和Vimentin共表達(dá)于肺上皮細(xì)胞表面;進(jìn)一步在動(dòng)物模型中檢測(cè)到GVHD組小鼠肺組織上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著低于BMT組，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志Vime

13、ntin的蛋白表達(dá)水平顯著升高，且這種變化隨著移植時(shí)間的延續(xù)而差異更加明顯。與對(duì)照組相比較，GVHD組小鼠肺組織中的EMT信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白分子β-catenin、Claudin-1和轉(zhuǎn)錄因子Slug的表達(dá)水平均明顯升高。這些結(jié)果提示在GVHD肺損傷發(fā)生發(fā)展過程中存在EMT。
　　研究結(jié)論：
　　1)構(gòu)建了穩(wěn)定的C57BL/6→BALB/C aGVHD肺損傷動(dòng)物模型，并通過觀察aGVHD小鼠肺組織病理改變和膠原沉積情況，證實(shí)了

14、aGVHD小鼠肺組織中存在纖維化現(xiàn)象。
　　2) aGVHD肺損傷小鼠在移植早期以CD4浸潤(rùn)為主，到移植后期轉(zhuǎn)變?yōu)橐訡D8浸潤(rùn)為主，提示在aGVHD肺損傷過程中出現(xiàn)CD4→CD8淋巴細(xì)胞飄移。
　　3)aGVHD小鼠肺組織內(nèi)細(xì)胞因子的失平衡可能為啟動(dòng)GVHD肺損傷致肺纖維化發(fā)生發(fā)展的“開關(guān)”。
　　4)在GVHD肺損傷過程中存在EMT，肺組織內(nèi)微環(huán)境的改變可導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT使上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，是早期肺損傷