BMPR1A介導(dǎo)的信號通路對成骨細(xì)胞數(shù)量及終末分化的作用.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)由Urist發(fā)現(xiàn)并命名，被認(rèn)為是在肌肉等軟組織中誘導(dǎo)異位骨化的因子，隨后BMPs被證實也參與機(jī)體的多種器官組織的發(fā)育和形成，在機(jī)體中的多種細(xì)胞中發(fā)揮廣泛的生物作用。BMPs通過激活Smad依賴性通路和非Smad依賴性通路來影響基因表達(dá)。近年來關(guān)于不同物種、不同細(xì)胞、不同時間干預(yù)BMP信號通路的研究發(fā)現(xiàn)均可以導(dǎo)致骨量的不同變化，但具體機(jī)制尚不明了，且存在很大的爭議。目前的研究較多關(guān)注的是骨量的增多與減少，卻很少涉

2、及骨的質(zhì)量問題。
　　骨發(fā)生蛋白1A型受體-BMPR1A（也叫做Alk-3、Brk-1）與BMPs和BMPRⅡ同屬于TGF-β（轉(zhuǎn)化生長因子β）家族，BMPR1A是BMP2，BMP4的強(qiáng)有力的受體，直接影響B(tài)MP2，BMP4在通路中的作用。BMP2是骨誘導(dǎo)因子，可以誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞增生、分化為成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞，在骨的發(fā)生、誘導(dǎo)、修復(fù)等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。BMP2可直接或間接參與破骨細(xì)胞的形成、分化、成熟及活性;BMP4是一個關(guān)鍵的成

3、骨細(xì)胞因子，參與異位骨化的早期病變，對Ⅰ型膠原蛋白(COL1)、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(Ocn)的表達(dá)有刺激作用;BMP4可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化形成軟骨細(xì)胞，并促進(jìn)軟骨細(xì)胞的成熟。
　　成骨細(xì)胞由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來，主要參與骨的形成和骨損傷的修復(fù)過程?；钴S的成骨細(xì)胞位于骨形成表面。分化成熟的成骨細(xì)胞合成并分泌胞外基質(zhì)蛋白，包括各種膠原和非膠原蛋白、形成類骨質(zhì)及啟動骨的形成。成年機(jī)體的骨形成，受到嚴(yán)格的調(diào)控以維持骨的穩(wěn)態(tài)

4、。成骨細(xì)胞在骨形成過程中要經(jīng)歷成骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成熟、細(xì)胞外基質(zhì)礦化和成骨細(xì)胞凋亡幾個階段。很多因素可調(diào)節(jié)這幾個階段，從而最終調(diào)控骨形成。
　　目的：
　　鑒于成骨細(xì)胞數(shù)量及功能在骨穩(wěn)態(tài)維持中的重要作用，以及BMPR1A介導(dǎo)的BMP信號通路在骨發(fā)育和骨形成中的重要影響，在本實驗中，我們擬觀察:1.觀察成骨細(xì)胞其可能的機(jī)制;2.觀測BMPR1A介導(dǎo)的BMP通路對成骨細(xì)胞終末分化的影響，小鼠骨礦化、膠原合成等能力的影響，是

5、否導(dǎo)致小鼠骨質(zhì)量的變化，并探討其中可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分:成骨細(xì)胞中敲除BMPR1A在調(diào)控成骨細(xì)胞數(shù)量中的作用
　　1.建立成骨細(xì)胞特異性敲除BMPR1A小鼠模型，并觀察小鼠大體形態(tài)，測量體重和下肢骨長度;
　　2.利用X線攝片、microCT掃描、H&E染色等觀察小鼠骨量變化及骨組織結(jié)構(gòu)變化;
　　3.TRAP染色觀察破骨細(xì)胞數(shù)量及功能，BrdU免疫組織化學(xué)檢測成骨細(xì)胞增殖情況，TUN

6、EL法觀察成骨細(xì)胞和生長板肥大層細(xì)胞凋亡情況，
　　第二部分:成骨細(xì)胞中敲除BMPR1A對成骨細(xì)胞終末分化的調(diào)節(jié)作用
　　1.對小鼠下肢骨標(biāo)本進(jìn)行半脫鈣處理，進(jìn)行Von Kossa礦化結(jié)節(jié)染色、Masson染色、天狼星紅染色-偏振光顯微鏡等觀察礦化情況及膠原含量的變化，
　　2.利用免疫組織化學(xué)染色檢測成骨細(xì)胞標(biāo)志物OSX、Runx2、成骨礦化抑制因子OPN、FGF23的表達(dá);
　　3.測定血清中堿性磷酸酶及鈣、

7、磷含量，觀察小鼠鈣磷代謝是否正常;
　　4.小鼠長骨原代成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)，并進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，茜素紅染色觀察礦化水平，流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞周期變化。提取細(xì)胞總RNA，實時定量PCR檢測骨形成與骨吸收相關(guān)基因BMPR1A、β-catenin、RANKL、OPG的表達(dá)。
　　5.對小鼠下肢骨標(biāo)本，及牙齒組織標(biāo)本進(jìn)行處理后，掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及骨量變化。
　　結(jié)果：
　　一、成骨細(xì)胞中敲除BMPR1A小鼠的

8、松質(zhì)骨骨量增加明顯，主要由于成骨功能增強(qiáng)，破骨功能減弱導(dǎo)致。
　　1.通過對比3.2Cre與DMP1Cre的表達(dá)位置我們可以明確3.2Cre在成骨細(xì)胞中特異性表達(dá)，成骨細(xì)胞中敲除BMPR1A動物模型成立。
　　2.成骨細(xì)胞中敲除BMPR1A(cKO)小鼠與對照組相比外觀形態(tài)上無明顯差異，但其體型稍小，未見明顯的發(fā)育遲緩征象，但cko小鼠體重減輕，且下肢骨長度與對照小鼠對比有所縮短。
　　3.BMPR1A敲除小鼠松質(zhì)骨骨

9、量增加明顯。小鼠下肢骨的X線檢測發(fā)現(xiàn)，cKO小鼠長骨干骺端的放射密度較對照小鼠明顯增高。microCT結(jié)果提示在橫截面上，小鼠脛骨從松質(zhì)骨至皮質(zhì)骨cKO小鼠骨量均明顯增加，而脛骨組織切片的HE染色可見，cKO小鼠的松質(zhì)骨骨量明顯增多，這與正常的長骨結(jié)構(gòu)差異顯著。
　　4.cKO小鼠成骨細(xì)胞增殖及活性顯著增加。其成骨細(xì)胞標(biāo)志RunX2、Osterix表達(dá)升高，BrdU檢測成骨細(xì)胞增殖活動加強(qiáng)，TUNEL凋亡檢測成骨細(xì)胞凋亡減弱，

10、r>　　5.cKO小鼠破骨細(xì)胞活動減弱。cKO小鼠的骨組織中破骨細(xì)胞的數(shù)量減少，破骨細(xì)胞標(biāo)志RANKL表達(dá)水平減弱，體外分離培養(yǎng)骨細(xì)胞中RANKL/OPG基因表達(dá)比值有所降低。
　　二、成骨細(xì)胞中敲除BMPR1A小鼠成骨細(xì)胞終末分化受阻。
　　1.在體與離體礦化染色實驗結(jié)果提示cKO小鼠骨組織礦化能力減弱，掃描電鏡結(jié)果提示cKO小鼠的骨細(xì)胞之間失去了正常細(xì)胞間的連接突觸，無細(xì)胞與細(xì)胞間的緊密聯(lián)系，骨皮質(zhì)變薄，且孔隙增多，失去

11、了相互之間致密的連接。
　　2.BMPR1A敲除小鼠骨膠原合成能力減弱，Masson染色發(fā)現(xiàn)cKO小鼠長骨的膠原成分含量與對照小鼠相比減弱明顯，從膠原成分分析，cKO小鼠長骨中所含膠原大多為Ⅲ型膠原，Ⅰ型膠原含量很少，而對照組小鼠則是Ⅰ型膠原為主，Ⅲ型膠原較少;從膠原的排列上來看，cKO小鼠的膠原排列與對照組相比顯得雜亂無章，失去了正常的縱向規(guī)律的排列。
　　3.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果提示cKO小鼠骨組織中骨礦化抑制因子OPN

12、和FGF23的表達(dá)增強(qiáng)，血清中鈣水平與對照小鼠相比升高，而磷水平相對下降，cKO小鼠成骨細(xì)胞在細(xì)胞周期檢測中，有更多的細(xì)胞停留在了G期。
　　結(jié)論：
　　一、成骨細(xì)胞中敲除BMPR1A后，小鼠的成骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加，破骨細(xì)胞數(shù)量微量減少，小鼠骨量增加明顯。成骨細(xì)胞中BMPR1A信號通路對維持正常骨量有重要調(diào)控作用，可以通過調(diào)控成骨細(xì)胞數(shù)量以實現(xiàn)。
　　二、成骨細(xì)胞中敲除BMPR1A后，小鼠的成骨細(xì)胞終末分化受阻，會導(dǎo)致