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文檔簡介
1、腸道菌群及其代謝產(chǎn)物TMAO是動脈粥樣硬化性疾病潛在的一個(gè)新的預(yù)防和治療靶點(diǎn)。然而,迄今為止,國內(nèi)還罕見關(guān)于大動脈粥樣硬化性缺血性腦卒中/短暫性腦缺血發(fā)作(LAA/TIA)患者腸道菌群及血漿TMAO水平改變的研究。
目的:
為了研究LAA/TIA與腸道菌群及血漿TMAO水平間的相關(guān)關(guān)系,我們建立了一個(gè)病例對照研究。本研究擬分析LAA/TIA患者腸道菌群改變情況,初步了解腸道菌群與卒中事件的相關(guān)性;比較卒中患者與正常對
2、照的血漿TMAO水平差異,揭示血漿TMAO水平與腸道菌群可能存在的相關(guān)關(guān)系,并為將來的進(jìn)一步研究建立理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
方法:
本病例對照研究連續(xù)納入了從2014年2月至2015年2月入住南方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的急性腦卒中/TIA患者。初步納入的患者將根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格篩選合格病例,最終診斷為急性缺血性腦卒中,且TOAST分型為LAA的患者將進(jìn)入后續(xù)分析;而最終診斷為TIA,且有明確顱內(nèi)外動脈粥樣硬化斑塊的患者也將納
3、入后續(xù)分析。結(jié)合各項(xiàng)臨床數(shù)據(jù)證實(shí)與AS無關(guān)的缺血性腦卒中(如心源性等)和無明顯顱內(nèi)外AS斑塊證據(jù)的TIA患者將被剔除。對照組參與者來源于在南方醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的人群,對照組人群均已完善頸動脈彩超(CDFI)、經(jīng)顱彩色多普勒(TCD)和超聲心動圖(UCG)等檢查。所有患者均采集了入院后的首個(gè)空腹血液樣本(使用EDTA抗凝采血管)及入院48小時(shí)內(nèi)的首個(gè)糞便樣本。對照組人群收集其體檢當(dāng)天的空腹血樣及糞便樣本。所有血液樣本收集后,在低溫下運(yùn)送至
4、實(shí)驗(yàn)室,然后在4℃,3000轉(zhuǎn)/分鐘下低溫離心10分鐘,隨后抽取上清(血漿)凍存于-80℃。所有新鮮采集的糞便樣本將及時(shí)凍存于-80℃,直至進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
糞便樣本總DNA(腸道菌群總DNA)將嚴(yán)格根據(jù)說明書使用MOBIO強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒(MOBIO)進(jìn)行提取。所獲得的DNA產(chǎn)物及時(shí)凍存于-20℃以備后期進(jìn)行PCR擴(kuò)增使用。在獲得腸道菌群總DNA產(chǎn)物后,我們以16s rRNA V4可變區(qū)域帶barcode的通用引物進(jìn)行
5、PCR擴(kuò)增,本研究所用上游引物是514F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA),下游引物是805R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。在獲得PCR產(chǎn)物后,我們將抽取少量產(chǎn)物進(jìn)行跑膠以確定獲得目標(biāo)條帶(提示DNA擴(kuò)增成功)。最終,所有的PCR產(chǎn)物經(jīng)定量混合后,統(tǒng)一送至華大基因公司(深圳,中國)進(jìn)行測序。測序方法采用Illumina Miseq(PE150)測序技術(shù)。在測序前原始序列將利用BIPES技術(shù)進(jìn)行預(yù)處理。
6、在獲得腸道菌群總DNA測序結(jié)果后,我們使用QIIME(1.8.0)進(jìn)行了腸道菌群的基礎(chǔ)分析。利用Usearch算法(Usearch algorithm)所有的序列被歸類為OTUs。OTU(Operational Taxonomic Units,分類操作單元)是人為的在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中,為了便于進(jìn)行分析,給某一個(gè)分類單元(品系,種,屬,分組等)設(shè)置的同一標(biāo)志。在生物學(xué)信息分析中,一般來說,測序得到的每一條序列來自一個(gè)菌。要
7、了解一個(gè)樣品測序結(jié)果中的菌種、菌屬等數(shù)目信息,就需要對序列進(jìn)行歸類操作(cluster)。通過歸類操作,將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組,一個(gè)小組就是一個(gè)OTU,或者說一個(gè)OTU代表一種細(xì)菌。通常在97%的相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)OTU的代表性序列根據(jù)序列的頻率進(jìn)行確定;代表序列利用PyNAST算法(PyNASTalgorithms)進(jìn)行校準(zhǔn)排齊處理;將去除嵌合體后的OTU中的代表序列插入FastTree軟件中,
8、以生成所有OTU代表序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行α-和β-多樣性分析。根據(jù)OTU數(shù)據(jù)的特點(diǎn),隨機(jī)森林分類模型利用R軟件包來分類來自患者和健康對照的樣本。為了確定LAA/TIA患者和對照組具有顯著差異的細(xì)菌類群,我們在兩組間進(jìn)行了LEfSe(linear discriminate analysissize effect)分析以比較兩組間的菌群差異。在本次分析中,我們將LDA(lineardiscriminate analysis
9、,線性判別分析)臨界值設(shè)置為3。
在進(jìn)行TMAO檢測前,所有血漿樣本均保持在-80℃環(huán)境下凍存。血漿TMAO測定采用克利夫蘭醫(yī)學(xué)中心研究人員建立的穩(wěn)定同位素稀釋液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)(6,460 Series Triple Quadrupole LC/MS,Agilent,USA)進(jìn)行定量檢測。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用R(3.0.2)完成。在本研究中,各項(xiàng)納入研究指標(biāo)均因未能同時(shí)符合Shapiro-Wilk正態(tài)性
10、檢驗(yàn)和Bartlett方差齊性檢驗(yàn),故我們采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Wilcoxon秩和檢驗(yàn)方法或Kruskal Wallis秩和檢驗(yàn)方法)來對兩組及多組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,成對樣本則用Nemenyi檢驗(yàn)法。分類變量采用卡方檢驗(yàn)。由于微生物組數(shù)據(jù)的多維性,我們在QIIME1.8.0平臺上進(jìn)行微生物組的Adonis檢驗(yàn)。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
在本研究中,最終共有435名急性缺血性腦卒中/TIA患者被初步納入研
11、究,經(jīng)過后期的篩選(嚴(yán)格執(zhí)行納入及排除標(biāo)準(zhǔn)),最終有322名LAA/TIA患者符合納入標(biāo)準(zhǔn)。所有322名患者均采集了入院后首個(gè)空腹血漿樣本,其中141名患者在入院48小時(shí)內(nèi)留取了合格的糞便樣本。對照組最終納入了符合入組條件的231名體檢者,其中97名對照組人員于體檢當(dāng)天留取了合格的新鮮糞便樣本。
首先,我們根據(jù)對照組頸動脈彩超結(jié)果是否存在AS改變將對照組分為3個(gè)亞組:明確存在頸AS斑塊形成組(AS亞組)、頸動脈內(nèi)膜中層厚度(i
12、ntima-media thickness)增加組(IMT亞組)及未發(fā)現(xiàn)明顯AS改變組(Non-AS亞組)。我們分析比較了對照組三個(gè)亞組間的血漿TMAO水平及腸道菌群,結(jié)果表明,三組間血漿TMAO水平及腸道菌群均未見顯著性差異。上述分析結(jié)果說明,在正常對照組中,AS與腸道菌群結(jié)構(gòu)和血漿TMAO水平均未見明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)關(guān)系。
然而,無論是利用傳統(tǒng)的PCoA(principal coordinate analysis,主坐標(biāo)分析
13、)分析法,還是基于隨機(jī)森林算法的機(jī)器學(xué)習(xí)分析法,LAA/TIA患者組(疾病組)的腸道菌群結(jié)構(gòu)則表現(xiàn)出了明顯不同于對照組的腸道菌群結(jié)構(gòu)。其中,α-多樣性分析表明疾病組具有較對照組明顯多樣化的腸道菌群?;谖醇訖?quán)的UniFrac距離分析,我們發(fā)現(xiàn)相比于Non-AS和IMT組,對照組AS亞組的腸道菌群結(jié)構(gòu)已經(jīng)表現(xiàn)出了傾向于類似LAA/TIA患者腸道菌群失衡改變的趨勢。這個(gè)結(jié)果說明,對照組AS亞組的腸道菌群結(jié)構(gòu)已經(jīng)出現(xiàn)了輕度的紊亂表現(xiàn),且這種紊
14、亂與疾病組相似。另外,LEfSe分析表明,疾病組患者腸道菌群含有更多的機(jī)會致病菌(有害菌),如腸桿菌屬、巨型球菌屬、脫硫弧菌屬等,而被廣泛認(rèn)可的有益菌如擬桿菌屬、普氏菌屬和柔嫩梭菌屬含量明顯下降。且這種菌群紊亂的改變在卒中較為嚴(yán)重的患者中更加明顯。
與此同時(shí),通過檢測兩組人群的血漿TMAO水平,我們發(fā)現(xiàn),與預(yù)期的結(jié)果相反,LAA/TIA患者血漿TMAO水平非但沒有出現(xiàn)升高,反而出現(xiàn)了較對照組顯著下降的現(xiàn)象(P<0.05)。
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