原代胚胎干細胞小鼠(F0-ESC mouse)的培育及其方法學(xué)研究.pdf

1、目的：利用Velocimouse技術(shù)原代（F0）培育完全來源于胚胎干細胞的小鼠（F0-ESC小鼠），分析探討該技術(shù)的相應(yīng)技術(shù)細節(jié)，以便為胚胎干細胞、誘導(dǎo)多能干細胞的鑒定和基因修飾小鼠制備等生命科學(xué)研究提供更為便捷、有效的技術(shù)平臺。
　　方法：通過顯微注射將10～15個G1-ESCs注入到野生型ICR小鼠的8細胞胚胎，轉(zhuǎn)至KSOM+AA培養(yǎng)液滴中體外培養(yǎng)48h后置熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)囊胚率、胚胎干細胞嵌合體囊胚率和胚胎干細胞純合子

2、囊胚率。部分顯微注射后的8-細胞胚胎置KSOM+AA培養(yǎng)液滴中體外培養(yǎng)2h后移植至假孕0.5d的野生型ICR雌鼠的輸卵管內(nèi)或者培養(yǎng)過夜后移植至假孕2.5d的野生型ICR雌鼠的子宮內(nèi)。產(chǎn)出小鼠后藍光激發(fā)下觀察，全身均為綠色熒光且毛色為黑色的初步判斷為ESC小鼠。將ESC小鼠與野生型ICR小鼠交配，根據(jù)其后代（F1）熒光觀察及毛色判定ESC小鼠是否為生殖腺傳遞。解剖ESC小鼠，觀察各器官熒光狀況判斷其全身器官是否均為胚胎干細胞細胞發(fā)育而來最

3、終確定其是否為F0-ESC小鼠。
　　結(jié)果：（1）顯微注射后體外培養(yǎng)至囊胚，熒光顯微鏡檢查表明18.54％的囊胚內(nèi)細胞團完全由G1-ESC形成；（2）培育出3只原代含有G1-ESC的小鼠，其中1只為F0-ESC小鼠（雄性），2只嵌合體小鼠；（3）將F0-ESC小鼠與野生型ICR雌鼠交配證實其為生殖腺傳遞；（4）F0-ESC小鼠各器官取材熒光觀察發(fā)現(xiàn)各器官均有熒光證實其為全身均為ES細胞發(fā)育而來的F0-ESC小鼠。
　　結(jié)論：