二化螟體內(nèi)生物胺受體的藥理學(xué)與生理學(xué)研究.pdf

1、昆蟲體內(nèi)的生物胺，主要包括章魚胺(octopamine，OA)、酪胺(tyramine，TA)和多巴胺(dopamine，DA)等。它們在昆蟲體內(nèi)扮演著各種重要的生理角色，協(xié)同或各自調(diào)控著昆蟲的多種行為和生理過程，如影響昆蟲的產(chǎn)卵、晝夜節(jié)律、嗅覺、抉擇、相變、好斗和飛翔以及學(xué)習(xí)和記憶等。三者的合成底物都是氨基酸酪氨酸，且酪胺是章魚胺的合成前體。在昆蟲體內(nèi)，它們主要是通過結(jié)合各自特異性的G蛋白偶聯(lián)受體來發(fā)揮作用。由于昆蟲體內(nèi)的生物胺受體一

2、直被視為殺蟲劑的潛在作用靶標(biāo)，近年來，對昆蟲體內(nèi)生物胺，尤其是其對應(yīng)受體的藥理學(xué)性質(zhì)和生理學(xué)功能研究日益受到關(guān)注。有鑒于此，本研究以水稻生產(chǎn)上的重要害蟲二化螟Chilo suppressalis(鱗翅目Lepidoptera:草螟科Crambidae)為研究對象，采用分子生物學(xué)等手段對其體內(nèi)的章魚胺受體(octopamine receptors，OARs)，酪胺受體(tyramine receptos，TARs)和多巴胺受體(dopam

3、ine receptors，DARs)的藥理學(xué)與生理學(xué)功能做了系統(tǒng)研究。
　　 1.CsOA1受體調(diào)控細(xì)胞免疫的研究
　　 本研究探索了章魚胺對昆蟲細(xì)胞免疫影響的分子機制（第二信使系統(tǒng)）。章魚胺在低濃度時(＜10-6 M)能夠提高二化螟幼蟲血細(xì)胞的延展和吞噬能力，然而在高濃度(＞10-5 M)時卻抑制血細(xì)胞的延展和吞噬反應(yīng)。相應(yīng)的，章魚胺刺激血細(xì)胞能夠偶聯(lián)胞內(nèi)兩種不同的信號通路，鈣離子(Ca2+)和環(huán)腺苷酸(cAMP)。

4、在低濃度章魚胺刺激血細(xì)胞時，其僅能提高胞內(nèi)Ca2+濃度，而在高濃度章魚胺刺激血細(xì)胞時，其既能引起Ca2+上升，又能引起胞內(nèi)cAMP升高。我們在血細(xì)胞上克隆到1型章魚胺受體(CsOA1)，通過原位雜交和免疫熒光等實驗技術(shù)確定其mRNA和受體蛋白表達(dá)于二化螟血細(xì)胞上。將其異源表達(dá)于HEK-293細(xì)胞后，與章魚胺對血細(xì)胞所引起的反應(yīng)類似，CsOA1也展示出了不同濃度章魚胺刺激可偶聯(lián)兩種信號通路的特性。因此，本實驗支持了以前的研究，章魚胺對昆蟲

5、先天免疫反應(yīng)的激活或抑制和其胞內(nèi)濃度有很大的關(guān)系。我們的結(jié)果也揭示出章魚胺很有可能是通過結(jié)合于血細(xì)胞膜上的CsOAl受體進(jìn)而偶聯(lián)不同信號通路來發(fā)揮免疫功能的。生物應(yīng)激反應(yīng)時所產(chǎn)生的激素對其免疫系統(tǒng)有著復(fù)雜的作用，本研究所得的結(jié)果可為腎上腺素及其受體是如何參與調(diào)控脊椎動物免疫反應(yīng)的研究提供參考。
　　 2.CsOA2B2受體的藥理學(xué)與生理學(xué)研究
　　 從二化螟體內(nèi)克隆得到一類2型章魚胺受體(CsOA2B2)，該基因與果蠅體

6、內(nèi)的CG6989(DmOA2B2)基因同源。表達(dá)譜分析表明，該基因主要表達(dá)于二化螟幼蟲神經(jīng)組織中。將其表達(dá)于HEK-293細(xì)胞后，在受到章魚胺刺激時，該受體能夠偶聯(lián)G。蛋白引起胞內(nèi)cAMP的上升，EC50值為2.33 nM，在章魚胺濃度為100 nM時所引起的cAMP反應(yīng)最大。藥理學(xué)實驗表明，激動劑中naphazoline特異性大于clonidine;拮抗劑中phentolamine，mianserin和chlorpromazine能夠

7、顯著拮抗章魚胺的激動效果。用這3種拮抗劑對二化螟幼蟲進(jìn)行活體藥理學(xué)干擾后，進(jìn)行行為測定的數(shù)據(jù)表明，經(jīng)mianserin和phentolamine處理的幼蟲運動能力顯著下降。
　　 3.一種新型章魚胺受體CsOA3的功能研究
　　 從二化螟體內(nèi)克隆得到一類孤兒受體，生物信息學(xué)分析表明其與果蠅體內(nèi)的CG18208基因同源，可能屬于生物胺受體家族成員。該基因通過可變剪切可產(chǎn)生兩個剪切體，CsOA3S和CsOA3L。CsOA3L

8、在內(nèi)膜3區(qū)處比CsOA3S多了30個氨基酸，該區(qū)域可能參與了受體與G蛋白的結(jié)合。為了研究其配體信息，偶聯(lián)的下游信號通路以及藥理學(xué)性質(zhì)，我們分別將兩種剪切體真核表達(dá)于HEK-293細(xì)胞中。實驗表明，兩類受體均能引起胞內(nèi)Ca2+的上升，而CsOA3S受體還可被章魚胺激活引起胞內(nèi)cAMP的下降，酪胺雖也可激活此類受體但特異性沒有章魚胺高。藥理學(xué)實驗表明,CsOA3受體可被多種激動劑激活，包括有機氮類殺蟲劑殺蟲脒和雙甲脒等，而拮抗劑中唯有phe

9、ntolamine和epinastine具有顯著的拮抗效果。定量PCR實驗表明，該基因主要以短剪切體CsOA3S的形式出現(xiàn)，并且廣泛表達(dá)于各類受測組織中，其中在神經(jīng)節(jié)和馬氏管中表達(dá)量最高。據(jù)我們所知，CsOA3是一類新型的章魚胺受體。
　　 4.CsTyR1受體的藥理學(xué)研究
　　 從二化螟內(nèi)獲得一個全長cDNA，序列分析表明，其為昆蟲TyR1受體家族，將其命名為CsTyR1。CsTyR1基因表達(dá)于各組織中，包括血細(xì)胞，脂

10、肪體，中腸，馬氏管，神經(jīng)節(jié)和表皮，而在神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)量是其它組織的16-80倍。我們將構(gòu)建的CsTyR1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于HEK-293細(xì)胞中，對其功能和藥理學(xué)特性做了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明，酪胺和章魚胺能夠顯著降低forskolin誘導(dǎo)的cAMP含量，并且存在劑量效應(yīng)反應(yīng)(酪胺，EC50=369 nM;章魚胺，EC50=978 nM)。結(jié)果表明，該類受體主要是偶聯(lián)Gi蛋白引起胞內(nèi)cAMP的下降。在受測的激動劑中,CsTyR1可被cloni

11、dine和雙甲脒激活而不能被naphazoline和殺蟲脒激活。拮抗劑中，酪胺的作用可被10μtM的yohimbine，phentolamine和chlorpmmazine所阻斷。
　　 5.CsTyR2受體的藥理學(xué)研究
　　 克隆到編碼CsTyR2受體的基因全長，序列分析表明其與果蠅和家蠶體內(nèi)克隆到的2型酪胺受體同源。組織分布研究發(fā)現(xiàn)，其主要表達(dá)于二化螟幼蟲的神經(jīng)節(jié)和馬氏管中。將該基因表達(dá)于HEK-293細(xì)胞所做的功能

12、試驗表明，其特異性的被酪胺激活后引起胞內(nèi)Ca2+的上升，EC50值約為20 nM。而另3種生物胺，章魚胺，多巴胺和5-羥色胺在10μM濃度下刺激該受體也未見有Ca2+反應(yīng)，表明該類受體是特異性的酪胺受體，且偶聯(lián)Gq蛋白引起胞內(nèi)Ca2+上升。所測定的4種激動劑，雙甲脒、殺蟲脒、clonidine和naphazoline在10μM濃度下均不能有效刺激該受體，表明該類受體與之前的章魚胺和酪胺受體在藥理學(xué)上差異甚大。
　　 6.D1-l

13、ike和D2-like多巴胺受體的藥理學(xué)研究
　　 從二化螟體內(nèi)克隆得到3種多巴胺受體，分別命名為CsDOP1，CsDOP2和CsDOP3，其中CsDOP1和CsDOP3獲得了全長序列。序列分析表明，CsDOP1和CsDOP2屬于昆蟲D1-like受體家族，偶聯(lián)Gs蛋白引起胞內(nèi)cAMP的上升,CsDOP3屬于昆蟲D2-like受體家族，偶聯(lián)Gi蛋白引起胞內(nèi)cAMP的降低。將CsDOP1和CsDOP3受體分別表達(dá)于HEK-293細(xì)

14、胞后，對它們的藥理學(xué)性質(zhì)做了研究，多巴胺對兩受體的激活都有明顯的劑量效應(yīng)(CsDOP1，EC50=20 nM; CsDOP3，EC50=670 nM)。我們測定了一系列的激動劑和拮抗劑對CsDOP1和CsDOP3受體的影響。CsDOP1中，激動劑效能大小順序為6，7-ADTN＞多巴胺＞bromocriptine＞ pramipexole;而受測的拮抗劑中，有拮抗效果的拮抗劑，其效能大小順序為，SCH23390＞butaclamol＞ch

15、lorpromazine＞phentolamine＞yohimbine＞propranolol＞ketanserin＞ flupenthixol＞ mianserin; CsDOP3不但偶聯(lián)的信號通路與CsDOP1截然相反，它們之間的藥理學(xué)性質(zhì)也差異較大，激動劑bromocriptine(EC50=280 nM)的效能大于多巴胺，而拮抗劑中epinastine=mianserin＞SCH23390=chlorpromazine，其它4種