低溫誘導(dǎo)高效異源表達(dá)載體pSW4的構(gòu)建和應(yīng)用研究.pdf

1、海洋是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng)，蘊(yùn)含著豐富的生物基因資源，深海是海洋的主要組成部分，普遍具有黑暗、高壓、低溫、寡營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境特征。由于絕大多數(shù)環(huán)境微生物無(wú)法在實(shí)驗(yàn)室中被培養(yǎng)，基因異源表達(dá)是獲取深海生物基因資源的理想途徑之一。目前常用的異源基因表達(dá)系統(tǒng)在使用過(guò)程出現(xiàn)的基因不表達(dá)、蛋白失活及形成包涵體等問(wèn)題在一定程度上限制了深海生物基因資源的開(kāi)發(fā)利用。因此，構(gòu)建或改造高效的深?；虮磉_(dá)體系對(duì)于深海來(lái)源活性蛋白的研究及利用具有很大的意義。
　

2、　本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)在深海細(xì)菌Shewanella piezotoleransWP3天然噬菌體SW1的基礎(chǔ)上構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pSW2。雖然其可用于缺失基因的回補(bǔ)和蛋白低溫表達(dá)，但pSW2作為表達(dá)載體仍存在一些問(wèn)題，例如載體序列冗余、復(fù)制起點(diǎn)未知、表達(dá)效率較低、沒(méi)有純化標(biāo)簽等。本研究通過(guò)對(duì)pSW2的最小化敲除、啟動(dòng)子替換及純化標(biāo)簽添加等改造，成功構(gòu)建了高效低溫誘導(dǎo)表達(dá)載體pSW4。以GFP為報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，pSW4的表達(dá)效率較pSW2有顯著

3、提升（20℃提高5～6倍，4℃提高10倍以上），利用該載體成功表達(dá)了深海細(xì)菌S.psychrophilaWP2的聚合酶亞基。WP3-pSW4體系適用于原位表達(dá)深海來(lái)源的蛋白，包涵體蛋白以及溫度敏感型蛋白(thermolabile proteins)。
　　此外，我們還對(duì)SW1的復(fù)制機(jī)制進(jìn)行了探討。通過(guò)載體突變及接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)確定并證實(shí)了絲狀噬菌體SW1上的復(fù)制起點(diǎn)是位于fpsR下游非編碼序列的一段91bp片段中，分析發(fā)現(xiàn)其存在典型回