粘球菌中mts基因簇調(diào)控胞外多糖產(chǎn)生及細(xì)胞表面粘附力的分子機(jī)制的研究.pdf

1、粘球菌是擁有復(fù)雜細(xì)胞行為的革蘭氏陰性滑動細(xì)菌，曾一度被認(rèn)為是陸生細(xì)菌。本實(shí)驗室經(jīng)過長期研究發(fā)現(xiàn)在海洋環(huán)境中也存在大量粘球菌，并分離獲得了一株典型的海洋耐鹽粘球菌Myxococcus fulvus HW-1，該菌株在海水的刺激下S運(yùn)動加強(qiáng)。S運(yùn)動的加強(qiáng)能夠增進(jìn)細(xì)胞之間的粘連性，可促使細(xì)胞粘附在固體介質(zhì)上進(jìn)而避免在潮汐過程中被海水沖走。相關(guān)的機(jī)制分析有助于我們深入了解粘細(xì)菌的起源和進(jìn)化。
　　前期的實(shí)驗表明mts基因簇可能參與了上述機(jī)

2、制。mts基因簇由6個基因組成，分別是mtsA至mtsF。在粘球菌的模式菌株Myxococcus xanthus DK1622中含有6個與其高度同源的基因，分別是MXAN1332至MXAN1337。生物信息學(xué)分析表明:mtsB、mtsC、MXAN_1333和MXAN_1334基因編碼的蛋白均含有一個能與鈣離子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域;mtsD，mtsE，MXAN1335和MXAN1336基因編碼的蛋白均含有一個vWFA(von Willebrand

3、 Factor)結(jié)構(gòu)域。凝血初期時該復(fù)合物在血小板粘附過程中發(fā)揮著十分重要的功能。結(jié)合有Ca2+離子的TSP(Thrombospondin)能夠作用于vWF的A3結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而破壞該結(jié)構(gòu)域中的二硫鍵，使vWF的巰基顯露出來繼而行使凝血功能。鑒于以上的分析，我們提出這樣一種假說:MtsB和MtsC蛋白在二價陽離子(例如Ca2+、Mg2+)信號的刺激下作用于MtsD/MtsE蛋白，并將信號傳遞出去。
　　由于海水中二價陽離子主要為Ca2

4、+和Mg2+，因此我們采用鈣鹽和鎂鹽的水溶液來代替海水，比較在相同濃度的二價陽離子作用下，M.fulvus HW-1菌株的S運(yùn)動是否仍然增強(qiáng)。實(shí)驗結(jié)果表明，在相同濃度的二價陽離子作用下，M.fulvusHW-1菌株的S運(yùn)動有一定程度的增強(qiáng)，但是效果沒有海水刺激下的明顯。
　　因為在M.fulvus HW-1中缺乏有效的遺傳操作手段，所以后面的實(shí)驗都是在模式菌株M.xanthus DK1622中展開的。接下來我們在M.xanthus

5、 DK1622中構(gòu)建了分別敲除MXAN_1333/MXAN_1334基因的菌株，及回補(bǔ)相應(yīng)mtsB/mtsC基因的菌株，細(xì)胞表面的粘附能力實(shí)驗表明，回補(bǔ)了mtsB、mtsC的菌株的表面粘附能力比沒有回補(bǔ)的菌株要強(qiáng)，由此可知基因mtsB、mtsC的回補(bǔ)能增強(qiáng)細(xì)胞表面的粘附能力，進(jìn)一步的實(shí)驗表明該增強(qiáng)過程是通過蛋白MXAN_1335和MXAN1336來實(shí)現(xiàn)的，且這兩個基因的蛋白可能是同功蛋白。
　　實(shí)驗室前期研究發(fā)現(xiàn)mts基因簇中的基

6、因編碼的蛋白能調(diào)控pilB和pilT基因編碼的蛋白。由于這兩個基因是控制四型菌毛伸長和收縮的兩個關(guān)鍵基因，因此mts基因簇有可能是通過調(diào)控細(xì)胞表面處于伸長狀態(tài)下的菌毛的數(shù)量來調(diào)控粘球菌的S運(yùn)動。同時我們還發(fā)現(xiàn)，在海水的刺激下不僅是菌體表面菌毛的數(shù)量增多，EPS的產(chǎn)量也相應(yīng)增多。這兩者之間是否有必然的聯(lián)系呢？我們在上述菌株的基礎(chǔ)上構(gòu)建了敲除pilA基因的菌毛缺失突變株，通過EPS定量實(shí)驗發(fā)現(xiàn)菌毛缺失突變株在海水的刺激下EPS產(chǎn)量仍然增多，

7、這表明粘球菌中存在不依賴于菌毛的其他EPS調(diào)控途徑。
　　那么mts基因簇是如何調(diào)控EPS產(chǎn)量的呢？結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道，我們猜測mts基因簇通過參與Dif信號系統(tǒng)來調(diào)控EPS的產(chǎn)量。Dif信號系統(tǒng)是調(diào)控EPS產(chǎn)生的一個信號路徑，由6個基因組成。其中difA、difC、difE是EPS產(chǎn)生的三個必須基因，缺失任何一個，EPS都將是缺陷的。為了驗證我們的假設(shè)，我們在敲除difA基因的基礎(chǔ)上回補(bǔ)了mts基因簇，發(fā)現(xiàn)該菌株在海水的刺激下EP

8、S的產(chǎn)量與野生菌株相當(dāng)。但difC基因缺失突變后，EPS產(chǎn)生了缺陷。Mts復(fù)合物似乎能夠繞過DifA蛋白而直接作用于其下游的DifC蛋白，進(jìn)而調(diào)控EPS的產(chǎn)生。酵母雙雜交實(shí)驗再次證明了該過程，MtsF與DifC之間存在相互作用。
　　結(jié)合實(shí)驗室前期的酵母雙雜交實(shí)驗結(jié)果，我們推測mts基因簇編碼的蛋白是以兩兩相互作用的蛋白復(fù)合體形式存在，而與DifC、PilB、PilT同時有相互作用的唯有MtsF，所以我們推測mts基因簇在接受海水