降糖三黃片對(duì)糖尿病腎病microRNA-21信號(hào)通路的影響.pdf

1、文獻(xiàn)研究:
　　糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病較為常見的微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致患者出現(xiàn)終末期腎臟疾病以及進(jìn)行腎替代治療的首要原因，嚴(yán)重地威脅著人們的健康。據(jù)研究報(bào)道，大約15％～40％的糖尿病患者會(huì)發(fā)展為糖尿病腎病。在我國(guó)，DN導(dǎo)致的終末期腎病的比例正在逐年上升，預(yù)計(jì)在不久的將來(lái)DN將成為終末期腎病最主要的原因。然而，DN的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，其具體機(jī)制至今尚未完全闡明清楚，可能是多種因素綜

2、合作用的結(jié)果，由于眾多生物活性物質(zhì)參與了DN的發(fā)病過(guò)程，使其病理生理機(jī)制具有多途徑、多環(huán)節(jié)相互作用的特點(diǎn)，故對(duì)其進(jìn)行有效的防治一直是臨床的難題。因此，探究DN的發(fā)病機(jī)制，尋求延緩DN進(jìn)展的治療方法具有重要的社會(huì)意義及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在整體觀念、辨證論治等思想指導(dǎo)下，中醫(yī)藥在防治糖尿病及其并發(fā)癥方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。中藥復(fù)方在干預(yù)防治疾病方面具有多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，因此，運(yùn)用中藥復(fù)方防治DN具有較大的潛力。中醫(yī)學(xué)對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的認(rèn)識(shí)源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，

3、早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》就有消渴病的相關(guān)記載，歷代醫(yī)家、后世學(xué)者對(duì)消渴病及其并發(fā)癥的病因病機(jī)認(rèn)識(shí)不斷發(fā)展，診治水平不斷提高?？偨Y(jié)古今中醫(yī)藥辨治DN的文獻(xiàn)，DN早期以氣陰兩虛、瘀熱互結(jié)為基本病機(jī)，治療宜益氣養(yǎng)陰、瀉熱逐瘀。降糖三黃片乃我校熊曼琪教授及其研究團(tuán)隊(duì)在經(jīng)方桃核承氣湯的基礎(chǔ)上加減化裁而成，在臨床上治療糖尿病腎病已二十余年，取得了良好的臨床療效。為進(jìn)一步證實(shí)該方的治療作用，更深入探討其可能的作用機(jī)制，我們進(jìn)行了本項(xiàng)研究，即借助糖尿病腎病的動(dòng)

4、物模型，觀察其對(duì)早期糖尿病腎病大鼠干預(yù)作用及對(duì)microRNA-21信號(hào)通路的影響。
　　實(shí)驗(yàn)研究:
　　目的:
　　利用糖尿病腎病模型大鼠，觀察降糖三黃片對(duì)模型大鼠糖脂代謝水平、腎功能、腎組織病理改變以及microRNA-21信號(hào)通路的影響，以探明降糖三黃片防治DN的作用機(jī)制，為降糖三黃片的臨床應(yīng)用提供現(xiàn)代生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)與支持。
　　方法:
　　選取80只雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，依據(jù)體重隨機(jī)

5、將其分成正常組10只和造模組70只。造模前禁食不禁水12 h，將配制好的STZ溶液按45 mg·kg-1的劑量一次性腹腔注射，正常組腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液。全部大鼠在同一動(dòng)物房?jī)?nèi)用代謝籠分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飲食，不使用胰島素及其他降糖藥物。連續(xù)喂養(yǎng)3周，然后測(cè)血糖、尿量，若血糖＞16.7mmol·L-1、尿量＞原尿量150％、24小時(shí)尿蛋白定量＞30mg以上，則可確定大鼠DN模型造模成功。造模期間大鼠死亡3只，血糖自行恢復(fù)3只，血糖達(dá)標(biāo)但

6、尿蛋白低于標(biāo)準(zhǔn)的大鼠8只，因此成模的DN大鼠共56只。將成模大鼠隨機(jī)分為模型組12只，降糖三黃片低劑量組11只，降糖三黃片中劑量組11只，降糖三黃片高劑量組11只，厄貝沙坦組11只。造模前后均以清潔級(jí)普通飼料喂養(yǎng)。降糖三黃片低劑量組按0.675g·kg-1給藥，降糖三黃片中劑量組1.350 g·kg-1給藥，降糖三黃片高劑量組2.700g·kg-1給藥，厄貝沙坦組0.0135g·kg-1給藥，灌胃前藥物均用純凈水配成2ml混懸液，每日1

7、次灌胃，連續(xù)8w。正常組及模型組予以灌服等量蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠的一般情況，每隔4周測(cè)大鼠體重及尾尖FBG，末次給藥后計(jì)24 h尿量及飲水量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)大鼠腎功能(BUN、Scr)，血脂(TC、TG、LDL-C、HDL-C)，糖化血紅蛋白(HbA1c)，24 h尿蛋白(Upro);取大鼠腎臟，計(jì)算腎重、相對(duì)腎重;光鏡及電鏡觀察大鼠腎臟組織病理形態(tài);免疫組化法觀察大鼠腎臟TGF-β1、Smad3、Smad

8、7的染色情況;Western blotting法檢測(cè)各組大鼠腎臟TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白的表達(dá);RTQ-PCR法檢測(cè)各組大鼠腎臟TGF-β1、Smad3、Smad7、microRNA-21 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.體重、飲水量及尿量方面:體重方面，藥物干預(yù)4周及8周后，較模型組，藥物干預(yù)組體重均有明顯增加（P＜0.01），其中以降糖三黃片高劑量組效果最好，降糖三黃片中劑量組次之，而降糖三黃片低劑

9、量組與厄貝沙坦組無(wú)差異(P＞0.05)。飲水方面，較模型組，降糖三黃片中劑量組、降糖三黃片高劑量組、厄貝沙坦組有所減少(P＜0.01)，而降糖三黃片低劑量組則無(wú)明顯差異(P＞0.05);與厄貝沙坦組比較，降糖三黃片低劑量組、降糖三黃片中劑量組無(wú)明顯差異（P＞0.05），而降糖三黃片高劑量組明顯少于厄貝沙坦組(P＜0.01)。尿量方面，降糖三黃片中劑量組、降糖三黃片高劑量組、厄貝沙坦組有所減少（P＜0.01），而降糖三黃片低劑量組則無(wú)明顯

10、差異（P＞0.05）;與厄貝沙坦組比較，降糖三黃片高劑量組尿量減少(P＜0.05)，而降糖三黃片中劑量組無(wú)差異(P＞0.05)，降糖三黃片低劑量組則高于厄貝沙坦組（P＜0.05）。
　　2.糖脂代謝方面:空腹血糖方面，治療4周后及8周后，降糖三黃片低劑量組、降糖三黃片中劑量組、降糖三黃片高劑量組均明顯低于模型組及厄貝沙坦組(P＜0.01)，模型組與厄貝沙坦組則無(wú)差異(P＞0.05)。糖化血紅蛋白方面，治療8周后，降糖三黃片低劑量組

11、、降糖三黃片中劑量組、降糖三黃片高劑量組均明顯低于模型組及厄貝沙坦組(P＜0.01)，模型組與厄貝沙坦組則無(wú)差異(P＞0.05)。TC、TG、LDL-C方面，治療8周后，降糖三黃片低劑量組、降糖三黃片中劑量組、降糖三黃片高劑量組均明顯低于模型組及厄貝沙坦組（P＜0.01），模型組與厄貝沙坦組則無(wú)差異（P＞0.05）。HDL-C方面，與模型組比較，降糖三黃片中劑量組、降糖三黃片高劑量組明顯升高(P＜0.01)，而降糖三黃片低劑量組、厄貝沙

12、坦組與模型組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　3.腎重、相對(duì)腎重、腎功能及尿蛋白方面:腎重方面，降糖三黃片中劑量組、降糖三黃片高劑量組、厄貝沙坦組明顯低于模型組(P＜0.01)，而降糖三黃片低劑量組與模型組無(wú)明顯差異（P＞0.05），降糖三黃片中劑量組、降糖三黃片高劑量組與厄貝沙坦組無(wú)明顯差異（P＞0.05），而而降糖三黃片低劑量組則明顯高于厄貝沙坦組(P＜0.01)。相對(duì)腎重方面，藥物干預(yù)組明顯低于模型組（P＜0.01），降糖三

13、黃片中劑量組、降糖三黃片高劑量組與厄貝沙坦組無(wú)明顯差異（P＞0.05），而降糖三黃片低劑量組則明顯高于厄貝沙坦組（P＜0.01）。腎功能方面(BUN、Scr)，藥物干預(yù)組明顯低于模型組(P＜0.01)，降糖三黃片高劑量組相較厄貝沙坦組無(wú)明顯差異(P＞0.05)，而降糖三黃片低劑量、降糖三黃片中劑量組則明顯高于厄貝沙坦組（P＜0.01）。24 h尿蛋白方面，治療前模型組與藥物干預(yù)組，組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)，治療8周后，與模型組比較

14、，降糖三黃片低劑量組降低(P＜0.05)，降糖三黃片中劑量組、降糖三黃片高劑量組、厄貝沙坦組降低更為明顯（P＜0.01）;與厄貝沙坦組比較，降糖三黃片高劑量組無(wú)明顯差異（P＞0.05），降糖三黃片低劑量組、降糖三黃片中劑量組則明顯高于厄貝沙坦組（P＜0.01）。
　　4.光鏡及電鏡下觀察腎臟病理形態(tài):正常組大鼠腎臟未見病理改變，模型組大鼠腎臟病變嚴(yán)重，可見腎小球體積增大明顯，腎小球腫脹、充血，腎小囊變窄，腎小球系膜細(xì)胞增生，部分腎

15、小管細(xì)胞肥大，部分可見空泡變性，毛細(xì)血管管腔狹窄，足突扁平，結(jié)構(gòu)不清，線粒體空泡樣變，系膜基質(zhì)增多，腎小管上皮細(xì)胞脫落、減少或萎縮。降糖三黃片低劑量組、降糖三黃片中劑量組、降糖三黃片高劑量組、厄貝沙坦組均能改善DN腎臟組織病變，其中以降糖三黃片高劑量組效果最好。
　　5.腎臟TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達(dá):免疫組化染色結(jié)果顯示，較正常組，模型組TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)明顯增多（P＜0.01），呈棕黃色顆粒，著

16、色極深，藥物干預(yù)組介于正常組與模型組之間，明顯低于模型組（P＜0.01）;與厄貝沙坦組比較，降糖三黃片高劑量組無(wú)明顯差異（P＞0.05），降糖三黃片低劑量組、降糖三黃片中劑量組高于厄貝沙坦組（P＜0.05）。較模型組，藥物干預(yù)組Smad7表達(dá)明顯增多（P＜0.01）;厄貝沙坦組Smad7表達(dá)明顯高于降糖三黃片低劑量組、降糖三黃片中劑量組、降糖三黃片高劑量組（P＜0.01）。Western blotting法測(cè)量TGF-β1、Smad3、

17、Smad7蛋白表達(dá)顯示:較正常組，模型組TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，降糖三黃片低劑量組低于模型組（P＜0.05），降糖三黃片中劑量組、降糖三黃片高劑量組、厄貝沙坦組明顯低于模型組（P＜0.01）;降糖三黃片高劑量組TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)與厄貝沙坦組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)，且厄貝沙坦組優(yōu)于降糖三黃片低劑量組及降糖三黃片中劑量組（P＜0.01或P＜0.05）。較正常組，模型組Smad7蛋白表達(dá)

18、明顯減少（P＜0.01），藥物干預(yù)組明顯高于模型組（P＜0.01），厄貝沙坦組Smad7蛋白表達(dá)明顯高于降糖三黃片低劑量組、降糖三黃片中劑量組(P＜0.01)，而與降糖三黃片高劑量組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　6.RTQ-PCR法檢測(cè)大鼠腎臟TGF-β1、Smad3、Smad7、microRNA-21 mRNA表達(dá)顯示:以正常組基因表達(dá)為參照，模型組TGF-β1、Smad3、microRNA-21 mRNA基因表達(dá)顯著增多（

19、P＜0.01），藥物干預(yù)組較模型組明顯降低(P＜0.01)，降糖三黃片高劑量組與厄貝沙坦組無(wú)明顯差異(P＞0.05)，而降糖三黃片低劑量組、降糖三黃片中劑量組明顯高于厄貝沙坦組（P＜0.01）。以正常組基因表達(dá)為參照，模型組Smad7mRNA基因表達(dá)顯著減少(P＜0.01)，藥物干預(yù)組較模型組明顯升高（P＜0.01），降糖三黃片高劑量組與厄貝沙坦組無(wú)明顯差異（P＞0.05），而降糖三黃片低劑量組、降糖三黃片中劑量組明顯低于厄貝沙坦組（P

20、＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.在總結(jié)前人各醫(yī)家關(guān)于消渴病因病機(jī)及證治的基礎(chǔ)上，總結(jié)糖尿病腎病病機(jī)屬虛實(shí)夾雜，正虛為本，邪實(shí)為標(biāo)，治以扶正祛邪為法，集益氣養(yǎng)陰、瀉熱逐瘀、通陽(yáng)活血、通腑泄?jié)嵊谝惑w，可有效防治本病。
　　2.降糖三黃片可以改善DN大鼠的一般狀態(tài)，具降低血糖、調(diào)節(jié)血脂的作用。
　　3.降糖三黃片可以降低DN大鼠的尿蛋白，降低血清BUN及Scr，具有一定保護(hù)DN大鼠腎功能的作用。
　　4.降糖