GM-CSF對2型糖尿病大鼠創(chuàng)面俞合治療作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:糖尿病患者創(chuàng)傷后創(chuàng)面不易愈合為臨床常見問題，其中又以2型糖尿病患者較為多見。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用2型糖尿病大鼠模型，探討外源性GM-CSF對2型糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合的影響及其機(jī)制。
　　 方法:取2月齡SPF級(jí)雌性大鼠70只，體重(200±15)g，在高脂高糖飼料環(huán)境下喂養(yǎng)6周后開始造模，造模前禁食12小時(shí)，不禁水。STZ用新配制的0.1mmol/L檸檬酸緩沖液(PH=4.2)稀釋，大鼠稱重后腹腔一次性注射STZ35mg/kg，4

2、8小時(shí)后血糖平穩(wěn)時(shí)進(jìn)行血糖監(jiān)測。選取造模成功的55只大鼠以10％水合氯醛(300mg/kg)腹腔麻醉后背部剃毛，在背部中線靠大腿兩側(cè)采用模具各制作直徑1.5cm的圓形創(chuàng)面，創(chuàng)面面積約為1.77 cm2。將皮膚沿畫線處切開，深至深筋膜下。隨機(jī)選取造模成功的40只大鼠分為2組:對照組為糖尿病(DM)創(chuàng)面20只，實(shí)驗(yàn)組為糖尿病創(chuàng)面+GM-CSF20只(創(chuàng)面注入GM-CSF0.5ug/kg)。另取15只大鼠分為5組，每組3只。A組:DM組;B組

3、:DM+腹腔注射生理鹽水組;C組:DM+腹腔注射GM-CSF;D組:DM+局部GM-CSF;E組:DM+局部生理鹽水組，大鼠分籠飼養(yǎng)。肉眼觀察各組大鼠術(shù)后第3、5、8、12、18天創(chuàng)面組織愈合情況，同時(shí)每天大鼠稱重，在尾靜脈抽血監(jiān)測血糖值。記錄每只大鼠的體重、血糖變化及身體狀況變化情況。利用透明方格紙沿創(chuàng)面愈合外緣描繪得到第3、5、8、12、18天的創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。沿愈合創(chuàng)面外緣超出約1cm切下創(chuàng)面組織，制片后光鏡觀察創(chuàng)面各類

4、細(xì)胞、深層組織愈合情況。取樣行透射電鏡觀察成纖維細(xì)胞形態(tài)，免疫組化實(shí)驗(yàn)觀察PCNA，BCL-2陽性細(xì)胞。
　　 結(jié)果:在各時(shí)間點(diǎn)上，注射GM-CSF藥物實(shí)驗(yàn)組愈合平均面積明顯大于對照組。在愈合時(shí)間上，實(shí)驗(yàn)組平均為19.50±1.29天，對照組為22.00±0.82天。HE染色:實(shí)驗(yàn)組第3天創(chuàng)面內(nèi)存在大量滲出物和大量中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞，細(xì)胞種類、數(shù)量多;對照組細(xì)胞數(shù)量少，組織結(jié)構(gòu)不清晰。實(shí)驗(yàn)組第5天組織結(jié)構(gòu)較清晰，開始存在少量肉

5、芽組織和腺樣結(jié)構(gòu);對照組大量細(xì)胞浸潤，細(xì)胞排列混亂。實(shí)驗(yàn)組第8-12天可見大量成纖維細(xì)胞，出現(xiàn)膠原束和皮膚結(jié)構(gòu)，組織分層愈合良好，出現(xiàn)上皮層和結(jié)締組織層，可見大量毛細(xì)血管和少量腺體生成;對照組第8-12天成纖維細(xì)胞數(shù)量較實(shí)驗(yàn)組少，存在少量炎性細(xì)胞，組織結(jié)構(gòu)不清晰。18天時(shí)兩組創(chuàng)面基本愈合，細(xì)胞種類減少，存在大量膠原束，毛細(xì)血管增多，基本恢復(fù)表皮結(jié)構(gòu);實(shí)驗(yàn)組表皮結(jié)構(gòu)較為光滑。透射電鏡觀察:實(shí)驗(yàn)組15000倍下可見成纖維細(xì)胞體積較大，形態(tài)完

6、好，周圍膠原分泌豐富(圖3);40000倍下可見細(xì)胞內(nèi)容物豐富，胞內(nèi)大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體，線粒體數(shù)量多、體積大，成纖維細(xì)胞無水腫、破裂情況（圖4）。對照組15000倍下成纖維細(xì)胞膠原分泌少，細(xì)胞內(nèi)有水腫（圖5）;40000倍下可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顯著擴(kuò)張，細(xì)胞內(nèi)容物少，出現(xiàn)水腫囊泡化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體數(shù)量少，線粒體數(shù)量較實(shí)驗(yàn)組少，部分線粒體模糊不清（圖6）。PCNA免疫組化結(jié)果:第3、5、8、12、18天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組PCN

7、A陽性表達(dá)平均值高于對照組，第3、5、8天陽性表達(dá)率顯著高于后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)證實(shí)第5、8天時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對照組之間陽性表達(dá)率P＜0.05，第3、12天時(shí)P＜0.01，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BCL-2免疫組化結(jié)果:對照組第3、5、8、12天時(shí)陽性表達(dá)低于實(shí)驗(yàn)組。在創(chuàng)面愈合過程中BCL-2表達(dá)在第3-8天最為明顯，第5天時(shí)達(dá)到峰值。實(shí)驗(yàn)組第5天時(shí)的BCL-2陽性表達(dá)，遠(yuǎn)高于對照組及其它各時(shí)間點(diǎn)。MMP-2的western blot檢測可見A