TNF-α和NF-κB在THP-1細(xì)胞促煤焦瀝青煙提取物誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞惡變過(guò)程中的作用.pdf

1、背景：眾多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及流行病學(xué)調(diào)查資料顯示,慢性炎癥與腫瘤發(fā)生之間存在因果關(guān)系。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是存在于腫瘤微環(huán)境中的炎癥細(xì)胞,在腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移起重要作用。腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)是由腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌、參與炎癥的重要細(xì)胞因子,可作為腫瘤的促進(jìn)因子。核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)是連接炎癥和癌癥的重要轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等相關(guān)基

2、因,參與人類(lèi)許多腫瘤發(fā)生。
　　 TNFR-TRADD-RIP-TRAF2-IKK-NF-κB通路是激活NF-κB的通路之一。煤焦瀝青廣泛存在于工業(yè)生產(chǎn)中,是煉焦作業(yè)后產(chǎn)生的副產(chǎn)物,現(xiàn)已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)列為確切致癌物。目前,大多數(shù)研究著重于煤焦瀝青這一單獨(dú)因素引發(fā)肺癌機(jī)制,而關(guān)于炎癥在其致肺癌的過(guò)程中作用如何、機(jī)制如何報(bào)道較少,

3、需要進(jìn)一步的研究進(jìn)行闡明清楚。
　　 課題組前期工作:利用中溫煤焦瀝青煙提取物(Coal tar pitch Volatiles,CTPVs)為染毒物,作用于人支氣管上皮細(xì)胞(Human Bronchial Epithelial Cells,BEAS-2B)后,BEAS-2B細(xì)胞出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化;利用BEAS-2B細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的前體人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞共培養(yǎng),THP-1細(xì)胞可促進(jìn)CTP誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化;且在細(xì)胞

4、的惡性轉(zhuǎn)化中NF-κB p65蛋白及基因表達(dá)量升高。在課題組前期工作的基礎(chǔ)上,該研究欲從THP-1分泌細(xì)胞因子TNF-α以及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TNFR-TRADD-RIP-TRAF2-IKK-NF-κB方面加以分析,探討炎癥促癌的可能機(jī)制,以期為煤焦瀝青所致職業(yè)性肺癌提供早期預(yù)防理論依據(jù)及肺癌早期診斷的生物標(biāo)志。
　　 方法：
　　 1.檢測(cè)兩種培養(yǎng)方式的細(xì)胞上清TNF-α的表達(dá)水平:BEAS-2B細(xì)胞與T

5、HP-1細(xì)胞共培養(yǎng),兩細(xì)胞培養(yǎng)比列為10:1,經(jīng)CTP染毒;單獨(dú)培養(yǎng)的BEAS-2B細(xì)胞經(jīng)CTP染毒。收集共培養(yǎng)細(xì)胞及單獨(dú)培養(yǎng)的BEAS-2B細(xì)胞代謝液上清,利用ELISA方法檢測(cè)不同培養(yǎng)方式細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)水平。
　　 2.檢測(cè)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化情況:共培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)至10代時(shí)分為3組:一組加入NF-κB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC),為PDTC組;一組

6、細(xì)胞加入TNF-α中和抗體,為中和抗體組;一組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),為對(duì)照組。3組細(xì)胞同時(shí)常規(guī)傳代培養(yǎng)至20代,應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)及染色體數(shù)目畸變分析檢測(cè)10代對(duì)照組、20代對(duì)照組、20代中和抗體組及20代PDTC組細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化指標(biāo)。
　　 3.檢測(cè)基因及蛋白的表達(dá)情況:利用Western Blotting檢測(cè)10代對(duì)照組、20代對(duì)照組、20代中和抗體組及20代PDTC組細(xì)胞總蛋白腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(

7、TNF receptor-associated factor2,TRAF2)、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)的蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞胞核蛋白NF-κB p65的表達(dá)水平。利用RT-PCR分別檢測(cè)TRAF2、CyclinD1、NF-κB p65 mRNA的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.ELISA測(cè)定共培養(yǎng)及單獨(dú)培養(yǎng)BEAS-2B細(xì)胞代謝液中TNF-α表達(dá)水平:結(jié)果顯示共培養(yǎng)細(xì)胞較單獨(dú)培養(yǎng)細(xì)胞在10代、15代、20代

8、、25代、30代時(shí)TNF-α的含量高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化情況:
　　 2.1 流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期:流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),20代對(duì)照組細(xì)胞相比10代對(duì)照組細(xì)胞G1期細(xì)胞比例減少(P＜0.05),S期細(xì)胞所占比例增加,表明經(jīng)CTPVs染毒的細(xì)胞隨著細(xì)胞代數(shù)的增加其惡性程度隨之增加。20代中和抗體組與20代PDTC組細(xì)胞S期細(xì)胞所占比例分別相比與對(duì)照組細(xì)胞較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

9、(P＜0.05)。
　　 2.2 染色體數(shù)目畸變分析:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在10代對(duì)照組細(xì)胞中,染色體數(shù)目異常已經(jīng)顯現(xiàn)。20代對(duì)照組較10代對(duì)照組細(xì)胞非2倍體數(shù)目增多;20代中和抗體組、20代PDTC組細(xì)胞分別與20代對(duì)照組比較,染色體畸變率較低,非2倍體數(shù)目降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0083)。
　　 2.3 軟瓊脂集落形成試驗(yàn):克隆形成以細(xì)胞數(shù)目超過(guò)50個(gè)為標(biāo)準(zhǔn),10代對(duì)照組細(xì)胞形成克隆數(shù)在20個(gè)左右;20代對(duì)照組

10、細(xì)胞形成大量克隆,惡性程度增高;20代中和抗體組以及20代PDTC組細(xì)胞克隆形成數(shù)目肉眼觀察明顯少于20代對(duì)照組;經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn):20代對(duì)照組與20代中和抗體組、20代PDTC組細(xì)胞相比差異分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.基因及蛋白的表達(dá)情況:
　　 3.1 TRAF2、CyclinD1,NF-κBp65基因表達(dá)情況:分別對(duì)10代對(duì)照組、20代對(duì)照組、20代PDTC組及20代中和抗體組TRAF2,Cycl

11、inD1、NF-κBp65mRNA進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,20代對(duì)照組細(xì)胞NF-κB p65,TRAF2、CyclinD1mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于10代對(duì)照組、PDTC組及中和抗體組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.2 TRAF2、CyclinD1、NF-κB p65蛋白表達(dá)情況:分別對(duì)10代對(duì)照組、20代對(duì)照組、20代PDTC組及20代中和抗體組TRAF2、CyclinD1、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較,結(jié)果顯示

12、,20代對(duì)照組胞核蛋白NF-κB p65,總蛋白TRAF2、CyclinD1相對(duì)表達(dá)量均高于10代對(duì)照組、PDTC組及中和抗體組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：THP-1細(xì)胞加速煤焦瀝青煙氣提取物誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞惡變過(guò)程中,THP-1可能通過(guò)分泌細(xì)胞因子TNF-α發(fā)揮作用;TNF-α與其受體相結(jié)合后可能通過(guò)TNFR-TRADD-RIP-TRAF2-IKK-NF-κB通路激活NF-κB,從而發(fā)揮促腫瘤的作用